吳現(xiàn)磊 ，宋錦添 2，侯鵬飛 ，秦二云 ，孟妍 ，張令巧

（1.濮陽市油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，河南濮陽 457001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/福建省腫瘤醫(yī)院消化道腫瘤內(nèi)科，福建 福州 350014）

胃癌是最常見的癌癥類型之一，在癌癥相關(guān)的死亡人數(shù)中排名第2[1]。早期胃癌可通過手術(shù)切除進(jìn)行治療，但大部分患者確診時已為晚期，靶向藥物治療是常用的治療方法，對癌癥基礎(chǔ)的復(fù)雜病理生理學(xué)的深入了解和對癌癥相關(guān)的分子生物標(biāo)志物的識別，推動了靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)[2]。

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程的一個關(guān)鍵特征是異常的血管生成，因此，抑制腫瘤血管生成或破壞現(xiàn)有腫瘤血管系統(tǒng)的藥物受到廣泛關(guān)注[3]。血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）是參與血管生成的兩種酪氨酸激酶受體之一，當(dāng)被其配體VEGF激活時能促進(jìn)血管形成、腫瘤增殖和遷移[4]。阿帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），它能高度選擇性地結(jié)合并強(qiáng)烈抑制VEGFR-2從而達(dá)到抑制血管生成的作用[5]。一項Ⅱ期研究顯示，與安慰劑相比，阿帕替尼改善了化療難治性晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者的OS和PFS[6]。隨機(jī)、安慰劑對照的Ⅲ期試驗進(jìn)一步證實阿帕替尼對至少有2種既往全身化療失敗的晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌的患者有療效[7]。但阿帕替尼在胃癌中的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)研究還不夠充分，有待進(jìn)一步研究完善。

SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白-5（SOX5）是SOX家族蛋白的一員，并作為轉(zhuǎn)錄因子參與胚胎的發(fā)育[8-9]。SOX5在各種類型的癌癥中起重要作用。據(jù)報道SOX5可能通過與yes相關(guān)蛋白1（YAP1）相互作用而成為致癌因子，從而促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和增殖[10]。此外，已發(fā)現(xiàn)SOX5可以促進(jìn)2型糖尿病患者的葡萄糖代謝[11]。而GLUT4是與糖酵解相關(guān)的基因[12]。目前，已有研究表明阿帕替尼能通過抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解調(diào)控胃癌的增殖和凋亡。但相關(guān)通路研究較少，且沒有關(guān)于SOX5/GLUT4信號軸在阿帕替尼抑制胃癌糖酵解中的研究。

本研究探討了阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸影響葡萄糖代謝抑制胃癌細(xì)胞活力。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

細(xì)胞代謝分析儀（美國安捷倫科技有限公司，型號Seahorse XFp）；酶標(biāo)儀（美國BioTek有限公司，型號ELx800）；qRT-PCR熒光定量儀（美國Applied Biosystems公司，型號7900HT）；乳酸比色測定試劑盒、葡萄糖攝取比色測定試劑盒（北京安諾倫有限公司）；CCK-8（日本Dojindo）；BCA定量試劑盒、Lipofectamine 2000（賽默飛世爾科技公司）；阿帕替尼（美國MedChemExpress公司，批號YN968D1）。

1.2 細(xì)胞系來源及培養(yǎng)

本研究中使用的細(xì)胞系為胃癌細(xì)胞系BGC-823（BNCC337689），購自北納生物（中國北京）。BGC-823在含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。阿帕替尼購自MCE（MedChemExpress）。稱取50 mg阿帕替尼溶于1 mL DMSO后放入?20℃冰箱保存，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組

重組質(zhì)粒pENTER-SOX5（oe-NC）和SOX5的過表達(dá)質(zhì)粒（oe-SOX5）、GLUT4的過表達(dá)質(zhì)粒（oe-GLUT4）均購自Vigene Biosciences（中國濟(jì)南）。根據(jù)生產(chǎn)商的說明通過Lipofectamine 2000（Invitro‐gen，Carlsbad，CA，USA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。并根據(jù)本課題實驗要求，分為：control組、不同濃度（0μmoL/L、10μmoL/L、20μmoL/L、30μmoL/L、40μmoL/L、50μmoL/L）阿帕替尼處理組（oe-NC+apatinib）、過表達(dá)SOX5并阿帕替尼處理組（oe-SOX5+apa‐tinib）、過表達(dá)GLUT4并阿帕替尼處理組（oe-GLUT4+apatinib）。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用Trizol（Invitrogen）按照制造商的方案從胃癌細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。qRT-PCR在ABI 7900HT儀器上進(jìn)行。使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參分別歸一化處理。所用引物見表1。結(jié)果用2?ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因相對表達(dá)量的差異。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 Western blot實驗

將各組細(xì)胞使用冷PBS洗滌3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后加入10μL上樣緩沖液95℃煮10 min后，于100 V進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉液（5%BSA/TBST）封閉60 min。加入一抗兔抗GLUT4（abcam，USA）、SOX5（abcam，USA）、β-actin（abcam，USA），4℃過夜孵育。一抗孵育完畢后，用1×TBST溶液（Solarbio，Beijing，China）室溫下?lián)u床搖動洗膜，5 min×3次，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG（abcam，USA），室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用ECL試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，拍照觀察蛋白印記。

1.6 細(xì)胞增殖能力測定

CCK8法測試細(xì)胞增殖能力。將5×103個胃癌細(xì)胞接種到具有100μL培養(yǎng)基的96孔板中的每孔中。設(shè)置空白孔（有培養(yǎng)基，無細(xì)胞）和對照孔（培養(yǎng)基不加藥，有細(xì)胞）。第2天，用不同濃度的阿帕替尼處理細(xì)胞。使用CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h。監(jiān)測48 h后的細(xì)胞存活率，并通過2次吸收后的吸光度測量評估存活細(xì)胞的數(shù)量。使用酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光值。將各測試孔的吸光度A減去調(diào)零孔吸光度A或?qū)φ湛孜舛華。各重復(fù)孔的吸光度A取平均數(shù)。細(xì)胞生存率=（加藥細(xì)胞吸光度A?空白吸光度A）/（對照細(xì)胞吸光度A?空白吸光度A）×100%。

1.7 糖酵解過程分析（葡萄糖攝取、乳酸生成、細(xì)胞外酸化速率）

將細(xì)胞預(yù)處理24 h，接種在96孔板中并保持過夜。去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后根據(jù)制造商的規(guī)程，使用葡萄糖攝取比色測定試劑盒測定葡萄糖攝取。為了測量乳酸，將細(xì)胞在不含酚紅的DMEM中（Hyclone，USA）培養(yǎng)15 h，然后收集培養(yǎng)基。使用乳酸比色測定試劑盒對乳酸水平進(jìn)行定量，并使用BCA蛋白測定試劑盒針對相應(yīng)的總蛋白質(zhì)水平對濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了測量細(xì)胞外酸化速率，將糖酵解壓力試劑盒中的藥物誘導(dǎo)劑分別加入加藥板上的各加藥孔中，其中葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖的使用濃度分別為10 mmol/L、1μmol/L及50 mmol/L。隨后采用細(xì)胞代謝分析儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率，并計算糖酵解能力值及糖酵解保留值。

1.8 GLUT4啟動子活性檢測

將長度約500 bp的GLUT4基因啟動子區(qū)作為pGL3-GLUT4-Promoter插入到pGL3堿性熒光素酶報告載體中。根據(jù)制造商的說明，使用QuikChange定點誘變試劑盒（Stratagene）對GLUT4啟動子進(jìn)行定點誘變，通過DNA測序確認(rèn)突變。將100 ng構(gòu)建的質(zhì)粒和7 ng Renilla熒光素酶對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到6孔板中SOX5過表達(dá)或沉默的細(xì)胞中。48 h后，使用雙熒光素酶測定試劑盒（Promega，USA）測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性。利用海腎熒光素將報告熒光素酶活性結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解的影響

檢測結(jié)果顯示，阿帕替尼可濃度依賴性地抑制BGC-823細(xì)胞的體外增殖（圖1A）。20μmol/L阿帕替尼處理后可顯著降低BGC-823細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取量（圖1B）和乳酸生成量（圖1C）。為進(jìn)一步證實阿帕替尼對胃癌細(xì)胞有氧糖酵解活性的抑制作用，細(xì)胞代謝分析儀檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，用阿帕替尼處理后，癌細(xì)胞外酸化速率降低。表明阿帕替尼可抑制由寡霉素（oligomycin）激活的BGC-823細(xì)胞的有氧糖酵解活性（圖1D）。進(jìn)一步對各糖酵解參數(shù)進(jìn)行計算，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，阿帕替尼處理組的BGC-823細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值均明顯下降（圖1E）。這些結(jié)果表明阿帕替尼能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。

圖1 阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解的影響Figure 1 Effect of apatinib on the proliferation and glycolysis of gastric cancer cells

2.2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性的影響

結(jié)果顯示SOX5和GLUT4的表達(dá)量均隨著阿帕替尼濃度的升高而下降（圖2A～圖2B）。20μmol/L阿帕替尼處理后，SOX5和GLUT4的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；阿帕替尼處理的同時過表達(dá)SOX5，SOX5和GLUT4的蛋白表達(dá)量相比于僅用阿帕替尼處理顯著上調(diào)（圖2C）。雙熒光素酶實驗檢測各處理組GLUT4啟動子活性，發(fā)現(xiàn)用阿帕替尼處理后GLUT4啟動子活性顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理細(xì)胞并過表達(dá)SOX5后，GLUT4啟動子活性明顯高于僅用阿帕替尼處理（圖2D）。這些結(jié)果表明阿帕替尼能通過SOX5調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性。

圖2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性的影響Figure 2 Effect of apatinib on the activity of GLUT4 promoter in gastric cancer cells through SOX5

2.3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解的影響

qRT-PCR檢測各處理組SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示阿帕替尼處理后SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5后,SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)GLUT4后SOX5 mRNA表達(dá)水平相較于僅用阿帕替尼處理沒有顯著變化，GLUT4 mRNA表達(dá)水平則發(fā)生顯著上調(diào)（圖3A）。CCK8檢測各處理組細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示阿帕替尼處理后細(xì)胞生存率顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5或GLUT4后，細(xì)胞生存率相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調(diào)（圖3B）。比色法結(jié)果顯示，阿帕替尼處理后葡萄糖攝取和乳酸生成速率均顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5或GLUT4后則發(fā)生顯著上調(diào)（圖3C～圖3D）。細(xì)胞代謝分析儀檢測結(jié)果顯示過表達(dá)SOX5或GLUT4能逆轉(zhuǎn)阿帕替尼對細(xì)胞外酸化速率的抑制作用（圖3E）。進(jìn)一步對各糖酵解參數(shù)進(jìn)行計算，結(jié)果表明，過表達(dá)SOX5或GLUT4能逆轉(zhuǎn)阿帕替尼對細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值的抑制作用（圖3F）。阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解。

圖3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解的影響Figure 3 Effect of apatinib on the cell viability and glycolysis of gastric cancer cells through the SOX5/GLUT4 axis

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，估計每年全球有超過100萬的新病例，同時由于胃癌的診斷往往處于晚期，其死亡率很高[1]。糖酵解是癌癥的一個新特征，糖酵解產(chǎn)生能量和營養(yǎng)，并產(chǎn)生乳酸，為癌細(xì)胞生長提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境[13]。因此，靶向糖酵解是一種新的治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸調(diào)控胃癌細(xì)胞糖酵解并有效抑制細(xì)胞活力。

阿帕替尼在晚期胃癌中被證實是一種安全有效的小分子抗血管生成靶向藥物，也是晚期胃癌標(biāo)準(zhǔn)化療失敗后，明顯延長生存期的單藥[14]。已有大量報道闡釋關(guān)于阿帕替尼對多種癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。例如Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬來調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長；阿帕替尼通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α和增加活性氧自由基水平促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡[16]；阿帕替尼通過AKTmTOR途徑誘導(dǎo)間變性甲狀腺癌保護(hù)性自噬和凋亡[17]。因此，推測阿帕替尼可能通過抑制特定的細(xì)胞功能，包括糖酵解來抑制胃癌細(xì)胞的活力。本研究使用不同濃度的阿帕替尼對胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼處理后癌細(xì)胞的糖酵解能力和細(xì)胞活力下降。

SOX5是SOX家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，在多種癌癥類型的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，SOX5通過激活twist介導(dǎo)的胃癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]；SOX5通過轉(zhuǎn)激活EZH2促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲[19]；SOX5通過STAT3信號通路誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)肺腺癌血管生成[20]。這表明SOX5在胃癌可能作為一種癌基因發(fā)揮作用。此外有文獻(xiàn)報道在卵巢癌細(xì)胞中，阿帕替尼能夠抑制SOX5，進(jìn)而抑制GLUT4的轉(zhuǎn)錄活性[21]。并且GLUT4已被證明與糖酵解有關(guān)[22]。本實驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道趨勢一致，表明在胃癌細(xì)胞中阿帕替尼能夠降低SOX5的表達(dá)，從而抑制GLUT4的啟動子活性，來發(fā)揮其抑制糖酵解作用。

本研究結(jié)果表明，阿帕替尼可能通過抑制SOX5/GLUT4信號軸，抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和細(xì)胞活力，為阿帕替尼調(diào)控糖酵解的機(jī)制提供了新的見解。