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        6種臨床常用藥物對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌作用

        2021-07-09 09:18:52黃曉燕甘燕玲曹玲陳麗丹王露霞
        關(guān)鍵詞:耐藥

        黃曉燕,甘燕玲,曹玲,陳麗丹,王露霞

        (中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510010)

        隨著碳青霉烯酶類抗生素使用的增多,導(dǎo)致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)出現(xiàn)并呈明顯上升趨勢(shì),成為臨床治療感染的新挑戰(zhàn)。目前對(duì)CRKP感染治療有效的藥物種類有限,臨床常采用聯(lián)合用藥治療的方案,因此,臨床治療策略的可行性分析,尤其是治療藥物的最佳搭配方案值得探索。本文選取臨床常用抗生素對(duì)CRKP進(jìn)行體外抗菌活性研究,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料、儀器與試劑

        1.1 菌株

        收集廣州地區(qū)某三甲醫(yī)院2018年10月?2019年9月臨床分離的616株非重復(fù)肺炎克雷伯菌,篩選出CRKP37株。其中來源于痰液(包含肺泡灌洗液)25(68%)株、血液5(13%)株、中段尿3(8%)株、引流液2(5%)株、腦脊液1(3%)株、膿液化1(3%)株;標(biāo)本主要分布在ICU 13(35%)株、老年ICU 10(27%)株、呼吸內(nèi)科6(16%)株、神經(jīng)外科4(11%)株、泌尿外科3(8%)株以及血液科1(3%)株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC8739,購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

        1.2 儀器與試劑

        運(yùn)用VITEK MSIVD3.0質(zhì)譜儀及其配套靶板、基質(zhì)液(法國(guó)生物梅里埃);Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統(tǒng)及其配套藥敏卡(法國(guó)生物梅埃);BIORAD基因擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂);DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司);Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂);DNA定量marker(北京天根生化科技有限公司);核酸染料(北京天根生化科技有限公司);瓊脂糖(西班牙Biow‐est);96孔平底培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司);Muller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景生物技術(shù)有限公司);Muller-Hinton(MH)肉湯(美國(guó)Difco公司);CAMHB肉湯干粉;多黏菌素B、亞胺培南、米諾環(huán)素、磷霉素、多西環(huán)素藥敏紙片(英國(guó)OXOID);替加環(huán)素(上海阿拉丁生化科技有限公司)。

        2 方法

        2.1 可疑產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的篩選

        運(yùn)用VITEK MSIVD3.0質(zhì)譜儀鑒定到種,使用Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統(tǒng)挑選對(duì)美羅培南或亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株,采用手工K-B法復(fù)檢,儀器法及手工法均耐藥者采用改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行耐藥表型確認(rèn)。

        2.2 改良Hodge試驗(yàn)

        用無菌生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922懸液,10倍稀釋后均勻涂布于MH平板,在平板中心貼厄他培南紙片。挑取3~5個(gè)血平板上過夜培養(yǎng)的新鮮待測(cè)菌和質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705菌落,垂直于紙片邊緣向外劃一條20~25 mm的直線,孵育后觀察結(jié)果,待測(cè)菌株與抑菌環(huán)交叉處出現(xiàn)矢狀生長(zhǎng)的為產(chǎn)碳青霉烯酶陽性株[1]。

        2.3 CRKP基因組DNA模板的提取

        采用熱激法制備CRKP的DNA模板[2]:用無菌棉簽將分離純化的細(xì)菌洗脫到200μL無菌蒸餾水中,并置于?20℃冰箱中1 min。取出后,將其放入預(yù)先準(zhǔn)備的100℃金屬水浴鍋中,靜置10 min,然后置于?20℃中保持1 min,然后離心(10 000 r/min)10 min使被裂解的細(xì)菌沉淀下來,將上清吸取到新的EP管中,該上清液即為提取的DNA模板溶液,將樣品儲(chǔ)存在?20℃冰箱中以備后用。

        2.4 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的擴(kuò)增

        使用PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的5種碳青霉烯酶基因KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48并鑒定。PCR擴(kuò)增體系(20μL):DNA模板1μL,上下游引物各1μL,5×PCR mix 10μL,去離子水7μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性30 s,94℃變性30 s,KPC、IMP、OXA、VIM、NDM5個(gè)基因在各自相對(duì)應(yīng)的退火溫度退火30 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)之后72℃徹底延伸5 min。所用引物見表1。

        表1 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因引物序列和預(yù)計(jì)片段大小Table 1 Primer sequence and predicted fragment size of carbapenemase gene of Klebsiella pneumoniae

        2.5 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因擴(kuò)增片段電泳鑒定

        用980 mL的去離子水與20 mL的50×TAE原液混合,稀釋至1×TAE緩沖液,以配置2%瓊脂糖凝膠和電泳液。反應(yīng)結(jié)束后,按順序在泳道內(nèi)分別加入10μL PCR產(chǎn)物,電壓設(shè)置為100 V,由負(fù)極向正極電泳30 min。電泳結(jié)束后,把凝膠放置在紫外光下,用Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。

        2.6 單獨(dú)藥敏試驗(yàn)

        采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定6種不同梯度濃度藥物對(duì)CRKP的體外最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),記錄結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSIM07-A10版,檢測(cè)時(shí)在肉湯培養(yǎng)基中加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖。

        2.7 聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)

        采用微量棋盤法,用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),把多黏菌素B、亞胺培南、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、磷霉素、多西環(huán)素(分別以A、B、C、D、E表示)組合成15個(gè)不同藥物組:A+B、A+C、A+D、A+E、A+F、B+C、B+D、B+E、B+F、C+D、C+E、C+F、D+E、D+F、E+F,檢測(cè)各藥物組MIC聯(lián)合;同時(shí)設(shè)定生長(zhǎng)對(duì)照(只加200μL菌懸液,無藥物)和無菌對(duì)照(只加200μL肉湯,無細(xì)菌)。每個(gè)組合各取相應(yīng)藥物50μL,按不同梯度濃度加入96孔板,充分混勻,把濃度為1×106CFU/mL的肺炎克雷伯菌懸液100μL加入所有孔中,使菌液終濃度大約為5×105CFU/mL,充分混勻,置35℃培養(yǎng)箱20 h,記錄MIC聯(lián)合,計(jì)算部分抑菌指數(shù)(fractitional inhibitory concentration index,FICI)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判斷依據(jù)[3]:FICI=MICA聯(lián)合/MICA單用+MIC聯(lián)合/MICB單用,F(xiàn)ICI≤0.5,協(xié)同作用;0.52.0,拮抗作用。

        3 結(jié)果

        3.1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)果見圖1。37株CRKP菌均為多重耐藥菌,對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類藥物具有極高的耐藥率,均≥80%;對(duì)四環(huán)素類的多西環(huán)素、米諾環(huán)素以及氨基糖苷類的阿米卡星、氟喹諾酮類的左氧氟沙星的耐藥率是72.2%~79.4%;對(duì)添加酶抑制劑的抗生素呈現(xiàn)中敏或高耐,為53.8%~97.9%;對(duì)復(fù)方新諾明表現(xiàn)為中敏(敏感率57.7%);對(duì)多黏菌素B及替加環(huán)素則呈高度敏感(敏感率92.8%、87.8%)。

        圖1 CRKP藥敏結(jié)果Figure 1 Drug sensitivity of CRKPstrains(%)

        3.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

        PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明37株菌都是CRKP。見圖2。

        圖2 部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 2 Agarose gel electrophoresis results

        3.3 抗菌藥物單獨(dú)及聯(lián)用對(duì)CRKP的體外抗菌作用

        3.3.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 15種藥物組合的MIC聯(lián)合均比MIC單獨(dú)值低,見表2。

        表2 不同藥物單用及聯(lián)用對(duì)CRKP的MIC值Table 2 MICvalues of CRKPin single and combined use of drugs ρ/(μg·mL?1)

        3.3.2 計(jì)算FICI、數(shù)據(jù)分析 見表3。結(jié)果6種藥物相互聯(lián)合,有協(xié)同作用株藥物組合的有A+D:13.51%(5/37株),A+E:40.54%(15/37株),B+C:13.51%(5/37株),B+E:75.68%(28/37株),B+F:5.41%(2/37株),C+E:8.11%(3/37株),D+E:16.22%(6/37株),E+F:5.41%(2/37株);有拮抗作用為A+B:24.32%(9/37株),A+F:27.03%(10/37株),B+C:8.11%(3/37株),B+D:70.27%(26/37株),B+E:8.11%(3/37株),B+F:54.05%(20/37株),C+D:5.41%(2/37株),C+E:13.51%(5/37株),D+E:2.7%(1/37株),E+F:2.7%(1/37株);其余表現(xiàn)為相加或無關(guān)。

        表3 CRKP體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of combined drugs sensitivity test of CRKP in vitro(n=37)

        4 討論

        CRKP感染的危險(xiǎn)因素包括入住ICU(病情重、住院時(shí)間長(zhǎng)、免疫力低下、多行開創(chuàng)性治療)、侵入性操作(有創(chuàng)呼吸機(jī)、深靜脈置管、尿道插管)、年齡(老年人、新生兒)、合并感染及碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用等。目前,對(duì)CRKP敏感的藥物僅有氨基糖苷類(尤其是慶大霉素)、氨曲南、多黏菌素B、磷霉素及替加環(huán)素,但臨床治療沒有明確的方案[4-5],碳青霉烯類藥物仍是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的首選抗生素[6],進(jìn)一步導(dǎo)致了碳青霉烯類耐藥菌株的出現(xiàn)[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì),替加環(huán)素、多黏菌素對(duì)碳青霉烯耐藥菌株具有抗菌活性[8],但單一用藥可使病原菌耐藥性逐漸增加[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道,磷霉素聯(lián)合多黏菌素B聯(lián)合使用,可殺滅65%以上的CRKP,磷霉素不推薦單獨(dú)使用[10]。也有研究表明,無論是在院病死率、細(xì)菌清除失敗率和14 d累積生存率,聯(lián)合用藥效果均優(yōu)于單藥(P<0.05)[11]。但目前臨床不同藥物組合的抗菌療效少有報(bào)道,并不確切。因此,本研究通過實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)臨床上6種常見抗菌藥物在單用或聯(lián)用對(duì)CRKP的體外抗菌活性,為臨床用藥提供參考或依據(jù)。結(jié)果顯示:最優(yōu)給藥方案是多黏菌素B及亞胺培南分別與磷霉素聯(lián)合,具有顯著的協(xié)同作用(分別占40.54%和75.68%),這與回顧性研究報(bào)道一致[12]。但同時(shí)也檢測(cè)出亞胺培南分別與替加環(huán)素及多西環(huán)素聯(lián)合具有明顯的拮抗作用(分別占70.27%和54.05%),提示臨床用藥應(yīng)避免使用此兩種組合給藥方案。另外,本實(shí)驗(yàn)中亞胺培南聯(lián)合替加環(huán)素應(yīng)用無協(xié)同作用,與Munoz-Price等[13]報(bào)道的應(yīng)用此組合成功治療CRKP感染病例結(jié)果不符,可能是替加環(huán)素起到主要抗菌活性作用,碳青霉烯類藥物的協(xié)同作用仍不清楚。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未有關(guān)于上述3種抗菌藥物組合對(duì)CRKP的體外抗菌作用的報(bào)道,可能是考慮到3種藥物聯(lián)用可能產(chǎn)生的肝、腎毒性過大。目前,市面上熱門的新型酶抑制劑復(fù)合頭孢他啶/阿維巴坦(CAZ/AVI),是廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦和第三代頭孢菌素相結(jié)合的抗生素,可抑制ESBLs及AmpC酶、KPC酶和部分D類β-內(nèi)酰胺酶,抑菌活性雖然弱于替加環(huán)素和多黏菌素B,但明顯優(yōu)于美羅培南、亞胺培南、厄他培南、多利培南[14],具有較好的應(yīng)用前景。

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