陳潮鋒 李 悅 直彥亮 姜自偉 石宇雄 梁錦成 劉 鋒 何德利

（1 廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院（廣州中醫(yī)藥大學(xué)番禺中醫(yī)院），廣東 廣州 511400；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

骨不連是創(chuàng)傷性骨折嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其治療仍是困擾廣大外科醫(yī)師和骨科醫(yī)師的難題。高齡與伴有多種基礎(chǔ)疾病為骨折和內(nèi)固定術(shù)后骨折愈合帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1]。在所有的骨折患者中愈合障礙的發(fā)生率為5%～10%[2]。其中有2%～5%的患者其骨折會在愈合過程中出現(xiàn)中止，進而引起骨折延遲愈合，甚至骨不連[3]。Wnt信號通路是與骨代謝關(guān)系密切的一個重要信號通路，與骨形成相關(guān)。DKK1（Dickkopf-1）是一種分泌型的糖蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)的抑制因子[4]。DKK1中和抗體（DKK1-Ab），能有效拮抗DKK1在Wnt/β-catenin信號通路的抑制效應(yīng)，促進骨形成，加快骨折的愈合速度[5]。既往研究表明，補腎養(yǎng)血方含藥血清可顯著促進沉默DKK1干預(yù)后細(xì)胞增殖和提高ALP活性，上調(diào)結(jié)締組織生長因子、骨保護素、骨橋蛋白的表達[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，補腎養(yǎng)血法可加快局部微循環(huán)修復(fù)，改善骨折端血液供應(yīng)，增強炎性細(xì)胞的吞噬功能[7]。但補腎養(yǎng)血方聯(lián)合DKK1-Ab治療的效果如何還未見報道?；诖?，本研究旨在探究基于Wnt通路的補腎養(yǎng)血法聯(lián)合DKK1-Ab治療對缺血型骨不連大鼠骨形成的治療效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 SPF級雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡10～12周，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[合格證SCXK（粵）2013-0034]。實驗動物分籠飼養(yǎng)，每籠最多5只。飼養(yǎng)室溫24～28 ℃，相對濕度為55%～65%，自由攝食水，每日照明12 h，黑暗12 h。

1.2 補腎養(yǎng)血方配制及DKK1-Ab干預(yù) 補腎養(yǎng)血中藥獨活寄生湯（獨活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、肉桂、細(xì)辛、秦艽、茯苓、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃各6 g），水煎、過濾、濃縮為2 g/mL的生藥，灌胃前使用蒸餾水配制成20 mg/mL的濃度，每日1次灌胃。DKK1-Ab以25 mg/kg在骨折部位附近皮下注射，每周2次。

1.3 實驗試劑 生理鹽水、補腎養(yǎng)血中藥購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；DKK1-Ab購于美國Abcom公司（批號ab196558）；戊巴比妥（批號20170325）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；12 cm手術(shù)用剪、10 cm眼用有齒鑷購自上海金鐘醫(yī)療手術(shù)器械廠；其余試劑均購于廣州菲博生物科技公司。

1.4 實驗動物分組與造模 將48只SD大鼠隨機分為4組：骨不連對照組、DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組及聯(lián)合治療組。分組后進行造模，具體造模方法：第1步克氏針固定，行腹腔麻醉（5%水合氯醛，5 mL/kg），常規(guī)消毒鋪巾，取左下肢髕骨內(nèi)側(cè)切口，縱行切開皮膚3 cm，將髕骨往外側(cè)牽拉使之脫位，顯露股骨髁間凹。用20號注射針自股骨髁間凹插入髓腔擴髓，然后取出注射針，逆行插入克氏針（直徑0.2 mm），從大轉(zhuǎn)子及皮膚穿出，克氏針遠(yuǎn)端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下，近端緊貼大轉(zhuǎn)子將尾部折彎剪除多余部分，隨后逐層閉合切口。第2步以改良Thamos法模擬高能量暴力所造成的股骨干閉合骨折，將動物右下肢外展內(nèi)旋位固定于骨折造模裝置的鐵砧凹槽上（鐵砧凹槽間距為15 mm），造模支架柱下端骨刀壓于大腿中部，由助手提起500 g的砝碼至35 cm處，讓其自由落體撞擊股骨，致股骨中段骨折。期間允許自由負(fù)重、活動，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。第3步對大鼠右側(cè)股動脈進行結(jié)扎，術(shù)前使用Doppler血流儀測量雙下肢血流灌注情況，在股骨干造模后，取側(cè)臥位，常規(guī)剃毛備皮，用75%乙醇消毒左下肢皮膚，常規(guī)消毒鋪巾。用眼科鑷夾起皮膚，用手術(shù)刀從左側(cè)腹股溝至大腿內(nèi)側(cè)作一1.0～1.5 cm的切口，在手術(shù)顯微鏡下依次分離各層組織，于血管鞘內(nèi)充分分離股動脈、股靜脈和股神經(jīng)，仔細(xì)游離股動脈，注意保護動脈，用2根8號可吸收線在股動脈遠(yuǎn)近端分別結(jié)扎，上端緊靠股動脈分支，下端距上端約5 mm（圖1）。用眼科剪將兩結(jié)扎點間的股動脈剪斷，隨后縫合皮膚[8]。期間允許自由活動，術(shù)后3 d常規(guī)予以青霉素抗感染。造模成功后按分組每日進行藥物灌胃，持續(xù)灌胃7 d，DKK1-Ab皮下注射2次。

1.5 HE染色檢測成骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞數(shù)及血管數(shù) 分別于干預(yù)后第14、28日分次處死各組小鼠。取骨折周圍1 cm的骨段（均分3份），將一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，后將其置于10%的EDTA-2Na溶液脫鈣（每2～3 d更換1次脫鈣液）。待骨質(zhì)松軟，針刺刀割無明顯阻力后表示脫鈣完成。以骨段縱軸為中心剖開骨段，經(jīng)系列乙醇脫水、透明、浸蠟、剖面向下，低熔點石蠟包埋。用全自動切片機切成厚度約5 μm的蠟片，將蠟片分別展于載玻片上，做好標(biāo)記，置于干燥箱中，42 ℃烤片48 h。石蠟切片經(jīng)2次二甲苯脫蠟，梯度乙醇下行至水略洗，Harris蘇木精溶液染色15 min后水洗，藍(lán)化入1%伊紅水溶液1 min，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇分色并上行至無水乙醇、二甲苯后，用中性樹膠封固。切片制作完成后用200倍光學(xué)顯微鏡觀察成骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞數(shù)及血管數(shù)。

1.6 免疫組化檢測VEGF、BMP-2含量 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測VEGF、BMP-2含量，根據(jù)VEGF、BMP-2ELISA試劑盒說明書進行操作，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟到水化后，滴加一抗，放置在4 ℃條件下12 h PBS沖洗3次，每次2 min；滴加二抗，在37 ℃條件下孵育30 min PBS沖洗3次每次2 min；使用DAB顯色試劑顯色。在400倍光學(xué)顯微鏡下檢測陽性信號灰度，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.7 β-catenin 蛋白質(zhì)印跡分析 如前述分4次，各組取1份（約250 mg）骨痂組織，加1 mL含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后抽提總蛋白。取出細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，刮下細(xì)胞，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep管中，冰上裂解細(xì)胞10～15 min，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，4 ℃高速離心15 min，取上清液。調(diào)整蛋白終濃度均為2 μg/μL，加入相同體積的緩沖液，混勻，沸水浴煮5 min，10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，封閉。加入一抗（兔抗人p120ctn 抗體1∶1000，鼠抗人GAPDH 抗體1∶5000，鼠抗Flag 抗體1∶5000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗孵育PVDF膜2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL發(fā)光劑，顯影、定影，分析β-catenin 含量

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間差異采用ANOVA方差分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織學(xué)檢查 干預(yù)14 d后，除骨不連對照組外，各組骨折損傷區(qū)的成骨細(xì)胞和血管數(shù)增多，與補腎養(yǎng)血中藥治療組比較，DKK1-Ab治療組、聯(lián)合治療組成骨細(xì)胞數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）；而補腎養(yǎng)血中藥治療組的血管數(shù)較DKK1-Ab治療組顯著升高（P＜0.05）。干預(yù)28 d后，與骨不連對照組比較，各組成骨細(xì)胞和血管數(shù)含量持續(xù)顯著升高（P＜0.05）；聯(lián)合治療組的血管數(shù)與補腎養(yǎng)血中藥治療組和DKK1-Ab治療組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中，補腎養(yǎng)血中藥治療組較DKK1-Ab治療組的血管數(shù)顯著升高（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

圖1 組織學(xué)切片，箭頭所指為成骨細(xì)胞

表1 4組大鼠的組織學(xué)指標(biāo)變化情況（）

表1 4組大鼠的組織學(xué)指標(biāo)變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養(yǎng)血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

2.2 補腎養(yǎng)血法對血清VEGF、BMP-2水平的影響 干預(yù)14 d后，與骨不連對照組比較，其余各組BMP-2、VEGF蛋白表達量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；補腎養(yǎng)血中藥治療組較DKK1-Ab治療組顯著升高（P＜0.05），而聯(lián)合治療組VEGF表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)28 d后，與骨不連對照組比較，其余各組BMP-2、VEGF蛋白表達量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合治療組的BMP-2表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖2 組織學(xué)切片，箭頭所指為血管

表2 4組大鼠的生長因子變化情況（）

表2 4組大鼠的生長因子變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養(yǎng)血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

2.3 補腎養(yǎng)血法對骨組織中β-catenin蛋白水平的影響 干預(yù)14 d后，與骨不連對照組相比，各組β-catenin蛋白表達相對較多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合治療組較DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)28 d后，DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組、聯(lián)合治療組β-catenin蛋白表達量與骨不連對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合治療組的β-catenin蛋白表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養(yǎng)血中藥治療組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠的β-catenin蛋白變化情況（）

表3 4組大鼠的β-catenin蛋白變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養(yǎng)血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

3 討 論

在臨床上，缺少血液供應(yīng)支持是導(dǎo)致骨折延遲愈合或骨不連的一個重要因素。在本實驗中，通過結(jié)扎大鼠的股動脈，對股骨中段使用三點沖擊法進行造模，而通過既往的預(yù)實驗，已經(jīng)明確了該造模法接近臨床，通過這種造模方法可造成急性缺血的微環(huán)境而不損傷軟組織，可有效避免由于骨膜組織和骨髓的過度損傷而帶來的影響。骨不連在祖國醫(yī)學(xué)中歸屬到“骨虛”、“骨萎”范疇，系邪盛正衰、腎精耗傷，氣血兩虛不能運行而氣滯、血瘀所致，“虛”、“瘀”并存，本虛標(biāo)實，故標(biāo)本同治，才能相得益彰。肝腎兩臟，皆為要本，不可偏廢，肝主筋，主藏血，筋束骨，筋骨相連。由此從理論上確立了調(diào)補肝腎是促進骨折愈合的重要環(huán)節(jié)。陳士鐸言“骨傷必內(nèi)動于腎，筋傷必內(nèi)動于肝，腎不生髓則不能養(yǎng)骨，血不濡筋，則筋松而不能束骨”。獨活寄生湯出自唐?孫思遂《備急千金要方》。專為痹證日久，肝腎兩虧，氣血不足而設(shè)。癥見腰膝疼痛，肢節(jié)屈伸不利，或麻木不仁，畏寒喜溫，心悸氣短，舌淡苔白，脈象細(xì)弱等。功能補氣血，益肝腎，祛風(fēng)濕，舒筋骨，止痹痛。獨活寄生湯作為中醫(yī)的經(jīng)典方劑，已被廣泛用于膝關(guān)節(jié)炎、腰痛等骨科疾病的臨床治療中。方中黨參、茯苓、甘草補氣健脾，建運化生之源。正旺則邪自除，當(dāng)歸、川芎、地黃、白芍養(yǎng)血又兼活血，即所謂治風(fēng)先活血，血行風(fēng)自滅牛膝、杜仲、寄生祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋壯骨，獨活祛風(fēng)、善祛下焦與筋骨間之風(fēng)寒濕邪，防風(fēng)祛風(fēng)邪以勝濕，秦艽除風(fēng)濕而舒筋，且又風(fēng)能勝濕，風(fēng)去濕自除，佐以細(xì)辛發(fā)散陰經(jīng)風(fēng)寒，搜剔筋骨風(fēng)濕以鎮(zhèn)痛。綜合全方，祛邪扶正，標(biāo)本兼顧，可使血氣足而風(fēng)濕除，肝腎強而痹痛愈。本研究中聯(lián)合治療組骨愈合效果明顯優(yōu)于其他3組，說明獨活寄生湯對于骨的生長以及血管生成具有促進的作用[9]。補腎養(yǎng)血法干預(yù)后血管數(shù)與VEGF水平較DDK1-Ab治療有統(tǒng)計學(xué)意義，說明補腎養(yǎng)血法通過改善骨不連模型的缺血狀況來改善局部的營養(yǎng)狀況及促進局部生長因子的聚集，繼而促進骨的愈合[10]。與既往通過促進骨愈合改善骨不連的報道不同，本研究揭示了血管在骨不連的作用以及補腎養(yǎng)血法治療骨折不愈合的潛在機制。

骨不連是骨科臨床上面臨的諸多重要難題之一，目前西醫(yī)常采用手術(shù)治療，如自體骨移植或干細(xì)胞移植等方法，又或通過沖擊波、電刺激局部改善局部微循環(huán)[11]。其手術(shù)效果一般，主要是無法使纖維、軟骨組織轉(zhuǎn)變?yōu)楣墙M織。多數(shù)骨不連患者都存在受傷時間較長、氣血雙虧、肝腎不足，故而對筋骨、肌肉的生成產(chǎn)生阻礙[12]。局部損傷后血液阻滯血流不暢，久傷引起氣滯血瘀、經(jīng)絡(luò)不通，筋骨長期得不到滋養(yǎng)，最終都會影響骨折的愈合。本實驗通過制備缺血型骨不連模型，配合補腎養(yǎng)血法干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補腎養(yǎng)血法可改善骨不連，而潛在機制可能是改善局部的血供[13]。

綜上所述，過表達DKK1可改善骨不連愈合效果。補腎養(yǎng)血法可改善實驗大鼠的骨不連情況，其機制可能與改善局部血液供應(yīng)相關(guān)，但其起主要作用的成分以及治療骨質(zhì)疏松的其他機制還有待進一步研究。