郝朝輝 張楠 陳昆 葛雷

作者單位：鄭州人民醫(yī)院泌尿外科（鄭州市450000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，由于初期發(fā)病隱匿，許多患者確診時(shí)已出現(xiàn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良[1]。研究發(fā)現(xiàn)包括miR-182 在內(nèi)的多種miRNA在膀胱癌組織中異常表達(dá)，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[2]。miR-182 通過調(diào)控不同的靶點(diǎn)參與乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。目前，關(guān)于miR-182 在膀胱癌細(xì)胞中作用機(jī)制的研究較少。本研究旨在對(duì)膀胱癌組織中miR-182-5p 及FOXO3的表達(dá)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-182-5p 與FOXO3的靶向關(guān)系，分析抑制miR-182-5p 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，以期為膀胱癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料及組織標(biāo)本 選取2017年6月至2019年6月64 例于鄭州人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱癌的患者的臨床病理資料及組織標(biāo)本，術(shù)前均未行放療、化療及其他腫瘤相關(guān)治療。癌組織及癌旁組織標(biāo)本迅速置于液氮中凍存。根據(jù)膀胱癌組織中miR-182-5p 和FOXO3 的表達(dá)水平，將64 例膀胱癌患者分別分為miR-182-5p 高表達(dá)組和miR-182-5p 低表達(dá)組、FOXO3 高表達(dá)組和FOXO3 低表達(dá)組。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及主要試劑 膀胱癌T24 細(xì)胞和正常膀胱細(xì)胞SV-HUC-1 均購自北京北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院；DMEM 培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素雙抗均購自美國(guó)Invitrogen 公司；miR-182-5p 模擬物、miR-182-5p 抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照物（miR-NC）均購自廣州銳博生物有限公司；Lipofectamine 2000 試劑購自美國(guó)Invitrogen 公司；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本Takara 公司；FOXO3 單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠的IgG購自英國(guó)Abcam 公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega 公司。

1.1.3 隨訪 對(duì)所有術(shù)后患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)64 例膀胱癌患者中11 例死亡，生存率為82.81%（53/64）。隨訪時(shí)間截至2020年6月。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 T24 和SV-HUC-1 細(xì)胞采用含有10% FBS，100 U/mL 青霉素/100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將T24 細(xì)胞接種至6 孔板中，分為空白組，miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）和miR-182-5p 抑制劑組（轉(zhuǎn)染miR-182-5p 抑制劑）。按照Lipofectamine 2000 試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h 后更換培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol 試劑提取組織及細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）反應(yīng)。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃15 s，共40 個(gè)循環(huán)。分別以U6 和β-actin 為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。其中ΔCt=Ct目的基因?Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組?ΔCt對(duì)照組。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 采用RIPA 裂解液提取組織和細(xì)胞總蛋白。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育FOXO3 單克隆抗體（1:1 000），4 ℃過夜。羊抗鼠的IgG 二抗（1:2 000）室溫孵育2 h。滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液，顯影、定影處理。以β-actin 為內(nèi)參，采用Image-J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將T24 細(xì)胞接種到24 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，分別將miR-182-5p 模擬物或miR-NC 及psiCHECK-FOXO3-野生型質(zhì)粒或psiCHECK-FOXO3-突變型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至T24 細(xì)胞。48 h 后，采用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，取0.1 mL 接種于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，取0.2 mL 細(xì)胞懸液加入上室，下室中加入含有10% FBS 的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。侵襲至下室的細(xì)胞使用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，PBS清洗后，使用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度。100 μL 細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫避光15 min，上機(jī)前5 min 加入PI 溶液5 μL，混勻。采用CytoFLEX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，不同時(shí)間點(diǎn)的多組間比較采用重復(fù)測(cè)量分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析并行Log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中miR-182-5p 和FOXO3 的表達(dá)

miR-182-5p在膀胱癌組織中的表達(dá)量為2.27±0.66，顯著高于癌旁組織的1.04±0.36，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）。與癌旁組織相比，膀胱癌組織中FOXO3 的表達(dá)水平顯著降低（圖1B～D）。膀胱癌組織中miR-182-5p 的表達(dá)水平與FOXO3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601,P＜0.001，圖1E）。

圖1 膀胱癌組織中miR-182-5p 和FOXO3 的表達(dá)

2.2 miR-182-5p 和FOXO3 與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-182-5p、FOXO3 與患者臨床病理特征見表1，其中腫瘤大小、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在miR-182-5p 高表達(dá)組和低表達(dá)組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而腫瘤大小、分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在FOXO3 高表達(dá)組和低表達(dá)組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 miR-182-5p、FOXO3 與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表1）

表1 miR-182-5p、FOXO3 與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-182-5p 和FOXO3 與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系

miR-182-5p 高表達(dá)組患者的生存率顯著低于低表達(dá)組（χ2=4.286，P=0.038），而FOXO3高表達(dá)組患者的生存率顯著高于低表達(dá)組（χ2=8.205，P=0.004，圖2）。

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線分析miR-182-5p 和FOXO3 與膀胱癌患者預(yù)后的相關(guān)

2.4 抑制miR-182-5p 上調(diào)FOXO3 的表達(dá)

T24 細(xì)胞中miR-182-5p 表達(dá)量為3.08±0.12，顯著高于SV-HUC-1 細(xì)胞的1.02±0.04，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-182-5p 抑制劑能夠抑制miR-182-5p 的表達(dá)（P＜0.05，圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染psiCHECKFOXO3-野生型質(zhì)粒后，miR-182-5p 模擬物組熒光素酶的活性低于miR-NC 組（P＜0.05，圖3B）。與空白組和miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-182-5p 抑制劑后，T24 細(xì)胞中FOXO3 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05，圖3C～E）。

圖3 miR-182-5p 抑制劑上調(diào)FOXO3 的表達(dá)

2.5 抑制miR-182-5p 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與空白組和miR-NC 組相比，miR-182-5p 抑制劑組細(xì)胞的增殖活性顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力

2.6 抑制miR-182-5p 表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

miR-182-5p 抑制劑組侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯低于空白組和miR-NC 組（P＜0.05，圖5）。

圖5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

2.7 抑制miR-182-5p 表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與空白組和miR-NC 組相比，miR-182-5p 抑制劑組的細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05，圖6）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況

3 討論

miR-182-5p 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Luo等[5]研究發(fā)現(xiàn)肺鱗癌中的miR-182-5p 高表達(dá)，并可作為肺鱗癌發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物，另有研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 靶向Bcl-2 抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[6]。Wei 等[7]利用miRNA 芯片分析發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中miR-182-5p 表達(dá)上調(diào)。Pignot 等[8]研究提示，miRNA-182-5p 表達(dá)上調(diào)可能與膀胱癌的浸潤(rùn)性有關(guān)。但也有研究表明，在膀胱癌組織中miR-182 表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)控Cofilin1 抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]。因此，在膀胱癌組織中關(guān)于miR-182-5p 表達(dá)及作用存在一定的爭(zhēng)議。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p在膀胱癌組織和T24 細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，抑制miR-182-5p 表達(dá)能夠抑制T24 細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，提示miR-182-5p 能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用。

miR-182-5p 能夠靶向調(diào)控下游靶基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，Zhao 等[10]研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-182-5p 表達(dá)可靶向上調(diào)PTEN 從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，Chang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 靶向調(diào)控FBXW7 和FBXW11，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用，另有研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 能夠抑制FOXO3a 表達(dá)調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡[12]。FOXO3 是FOX 家族的成員之一，參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等行為[13]。楊晗杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中FOXO3 低表達(dá)，與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。Chen 等[15]研究指出，在膀胱癌中miR-182-5p 表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXO3a 表達(dá)下調(diào)，與膀胱癌的預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3 在膀胱癌組織中低表達(dá)，與患者的預(yù)后不良有關(guān)，且抑制miR-182-5p 能夠上調(diào)FOXO3 表達(dá)。因此推測(cè)miR-182-5p 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲、抑制其凋亡可能是通過負(fù)調(diào)控FOXO3 實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，在膀胱癌組織中miR-182-5p 高表達(dá)、FOXO3 低表達(dá)，均與膀胱癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。miR-182-5p 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制其凋亡，可能與負(fù)調(diào)控FOXO3 表達(dá)有關(guān)。miR-182-5p 可能是膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)。