寧亞維，侯琳琳，于同月，韓盼盼，付浴男，李明蕊，王志新，賈英民,*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

苯乳酸是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型有機(jī)酸，具有廣譜的抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌以及真菌均有良好的抑菌作用，如單核細(xì)胞增生李斯特菌[1]、沙門氏菌[2]、赭曲霉、羅克福青霉菌等[3-4]。苯乳酸天然存在于泡菜、酸面團(tuán)等乳酸菌發(fā)酵的食品中[5-7]，可由大多數(shù)乳酸菌通過苯丙氨酸代謝途徑發(fā)酵生產(chǎn)[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸安全無(wú)毒，具有刺激免疫、減少腸道菌群中大腸桿菌的數(shù)量等生理作用[11-13]，上述優(yōu)點(diǎn)使苯乳酸在食品發(fā)酵生產(chǎn)和生物防腐等方面受到廣泛關(guān)注[14-15]。

食醋是最受歡迎的發(fā)酵調(diào)味品之一，在中國(guó)已有3 000多年的歷史[16]，每天的消耗量超過320萬(wàn) L。食醋除了具有調(diào)節(jié)酸度的作用外，還具有抑菌、降壓和降膽固醇等保健功效[17]，但食醋的生物活性成分尚未完全闡明。據(jù)報(bào)道，乳酸菌是食醋發(fā)酵過程中的主要菌群之一，與食醋的風(fēng)味和口感有關(guān)[18]。由于乳酸菌具有生產(chǎn)苯乳酸的能力，各種富含苯丙氨酸的谷物是制醋的原料（如糯米、高粱、稻米等），推測(cè)苯乳酸可以通過食醋中苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生[19-20]。此外，由于食醋對(duì)食源性致病菌具有廣譜抑菌活性，除了醋酸、乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸可發(fā)揮抑菌活性外[21]，是否還存在苯乳酸等其他尚未發(fā)現(xiàn)的有機(jī)酸有待進(jìn)一步挖掘研究。因此，食醋中新型有機(jī)酸的分析檢測(cè)具有重要的意義。本研究對(duì)食醋中的苯乳酸進(jìn)行分離鑒定并建立超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定方法[22-24]，廣泛分析我國(guó)市售食醋中的苯乳酸。在此基礎(chǔ)上，通過時(shí)間殺菌曲線和掃描電鏡技術(shù)首次考察苯乳酸與醋酸對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的聯(lián)合抑菌作用。以期為我國(guó)食醋新功能的開發(fā)及苯乳酸在食品防腐中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

72 種食醋樣品購(gòu)自石家莊、上海、南京、天津和太原等多地超市，涵蓋我國(guó)市售的大部分食醋種類，即陳醋（30 個(gè)樣品）、香醋（15 個(gè)樣品）、米醋（13 個(gè)樣品）、白醋（5 個(gè)樣品）、果醋（4 個(gè)樣品）和其他醋（5 個(gè)樣品）。

金黃色葡萄球菌ATCC 25923、枯草芽孢桿菌ATCC 6051、蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 9027、熒光假單胞菌ATCC 13525分別來自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；單核細(xì)胞增生李斯特菌10403s由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏。

苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30A超高效液相色譜儀 日本島津公司；QTRAP 6500 MS儀 美國(guó)AB SCIEX公司；3-18K冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Labdancer S25旋渦混合器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；S-4800-I掃描電鏡 日本日立公司；Adv-500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 德國(guó)布魯克公司；1525高效液相色譜儀（配備UV 2489檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；1200系列高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 食醋中苯乳酸的純化

將3 倍體積的甲醇加入食醋中沉淀蛋白質(zhì)，離心收集上清液，用活性炭脫色。脫色前用鹽酸（10 g/L）處理活性炭30 min，去離子水洗滌，在120 ℃真空干燥至恒質(zhì)量，然后冷卻至室溫。將75 g/L活性炭加入pH 6.5的食醋中處理，在55 ℃、200 r/min脫色30 min，然后離心除去活性炭，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮食醋混合物。

將上述預(yù)處理的食醋采用C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）純化，配備UV 2489檢測(cè)器的半制備高效液相色譜在波長(zhǎng)210 nm處進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相由0.05%三氟乙酸溶液（A）和0.05%三氟乙酸-乙腈溶液（B）組成，梯度洗脫以3 mL/min的流速進(jìn)行。梯度洗脫：0～30 min，95%～65% A，5%～35% B；30～35 min，65% A，35% B；35～45 min，65%～95% A，35%～5% B。收集苯乳酸，蒸發(fā)濃縮凍干后得到苯乳酸純品白色粉末。

1.3.2 食醋中苯乳酸的高效液相色譜-質(zhì)譜和NMR鑒定

首先，采用1200系列高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)按照1.3.1節(jié)相同色譜柱和分離條件對(duì)食醋中苯乳酸的分子質(zhì)量進(jìn)行初步鑒定。選取負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，采用氮?dú)庾鳛殪F化氣體。其次，對(duì)純化后的苯乳酸進(jìn)行NMR鑒定。采用DMSO-D6溶劑，使用NMR色譜儀記錄1H和13C譜，采用Topspin 3.5pl7軟件制作NMR波譜圖。

1.3.3 食醋中苯乳酸檢測(cè)方法的建立

1.3.3.1 流動(dòng)相選擇

采用配備雙泵和自動(dòng)進(jìn)樣器的LC-30A超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析。采用Phenomenex Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），通過等度和梯度2 種洗脫方式對(duì)苯乳酸進(jìn)行分析，最終確定流動(dòng)相為：0.3%甲酸溶液（A）和0.3%甲酸-乙腈溶液（B）；優(yōu)化梯度程序：0～1 min，90% A，10% B；1～4 min，90%～10% A，10%～90% B；4～5 min，10% A，90% B；5～5.1 min，10%～90% A，90%～10% B；5.1～6 min，90% A，10% B。流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件的選擇

采用QTRAP 6500系統(tǒng)和帶有電噴霧離子源的四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。Analyst version 2.0軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)采集。優(yōu)化系統(tǒng)的負(fù)電離工作模式，并對(duì)目標(biāo)化合物的監(jiān)測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。霧化氣壓力和輔助氣壓力分別設(shè)置為70 psi和60 psi。離子噴射電壓－4 500 V，渦輪噴射溫度500 ℃。碰撞室出口電位－12 V，入口電位－10 V，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，在100 ms下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行MRM，為獲得了最高的靈敏度和分辨率，在MRM模式下進(jìn)一步優(yōu)化裂解電壓和碰撞能等參數(shù)。

1.3.3.3 樣品的前處理

向1 mL食醋中加入3 mL甲醇振蕩20 min，然后以10 000×g離心10 min，收集上清液過0.22 μm濾膜。然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析苯乳酸含量，其中谷物類食醋上清液稀釋500 倍。

1.3.3.4 方法驗(yàn)證

采用線性范圍、檢出限、定量限、精密度、準(zhǔn)確度等方法進(jìn)行驗(yàn)證。采用溶劑和空白基質(zhì)以8 種質(zhì)量濃度（1～500 μg/L）建立校正曲線。采用醋酸溶液作為模擬基質(zhì)制備空白基質(zhì)，以食醋樣品中質(zhì)量濃度較高的600 mg/L醋酸溶液為模擬基質(zhì)，按樣品制備程序進(jìn)行處理。根據(jù)基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線與溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率比確定基質(zhì)效應(yīng)（信號(hào)抑制或增強(qiáng)）。分別根據(jù)RSN=3和RSN=10測(cè)定檢出限和定量限?；厥章蕿楸饺樗岬膶?shí)際質(zhì)量濃度與添加到食醋樣品中的已知質(zhì)量濃度（50、100、200、700 mg/L）的比值，精密度為回收率測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），即重復(fù)性（日內(nèi)RSD）和再現(xiàn)性（日間RSD）。

1.3.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯二倍稀釋法利用96 微量孔板測(cè)定苯乳酸和醋酸的MIC。在96 微量孔板第1列分別加入苯乳酸和醋酸，用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在2～11列進(jìn)行系列梯度稀釋，第11列不加苯乳酸和醋酸為陽(yáng)性對(duì)照，然后分別在1～11列中分別加入106CFU/mL菌懸液。12列只加營(yíng)養(yǎng)肉湯為陰性對(duì)照，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，以細(xì)菌被抑制的最低苯乳酸和醋酸的濃度為MIC。

1.3.5 苯乳酸和醋酸協(xié)同抑菌活性

1.3.5.1 苯乳酸和醋酸聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）

根據(jù)Gutierrez等[25]報(bào)道的方法，采用棋盤法在96 微量孔板上測(cè)定苯乳酸和醋酸的FICI。通過二倍稀釋分別制備質(zhì)量濃度范圍為1/32 MIC～4 MIC的苯乳酸和醋酸。不同MIC的苯乳酸以水平方向添加，醋酸以豎直方向添加。然后在棋盤中加入106CFU/mL菌懸液。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。FICI按下式計(jì)算：

FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FICI≤0.75，部分協(xié)同，0.75＜FICI≤1，相加作用；1＜FICI≤2，無(wú)關(guān)作用；FICI＞2，拮抗作用。

1.3.5.2 時(shí)間殺菌曲線

以金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，采用菌落平板計(jì)數(shù)法考察苯乳酸和醋酸的協(xié)同抑菌動(dòng)力學(xué)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的指示菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別加入苯乳酸、醋酸和2 種抑菌劑的組合，然后于37 ℃恒溫培養(yǎng)。分別在0、2、4、6、8、12、24 h取樣并通過稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制時(shí)間殺菌曲線。根據(jù)Jacqueline等[26]的報(bào)道，與最有效的單一抑菌劑相比，抑菌劑組合作用后菌落數(shù)減少不小于2（lg （CFU/mL））定義為協(xié)同抑菌作用。

1.3.6 掃描電鏡觀察菌體形態(tài)

利用掃描電鏡觀察苯乳酸和醋酸對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響。苯乳酸和醋酸處理的細(xì)菌在2.5%戊二醛溶液（0.1 mol/L PBS，pH 7.0）中4 ℃固定過夜。樣品用PBS（0.2 mol/L PBS，pH 7.0）清洗重懸3 次，分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液和2 次用100%乙醇脫水，然后用乙酸異戊酯置換乙醇2 次。樣品干燥后采用掃描電鏡觀察菌體超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次取其平均值，采用PASW Statistics 20.0軟件通過單因素方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并通過Origin Pro8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋中苯乳酸的高效液相色譜-質(zhì)譜和NMR鑒定結(jié)果

食醋由于風(fēng)味獨(dú)特以及抗菌、降血壓、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等功能特性廣受歡迎，但生物活性成分尚未完全闡明[21]。因此，采用高效液相色譜-質(zhì)譜以電噴霧離子源模式分析食醋中的有機(jī)酸。由于具有酸性質(zhì)子的化合物更容易形成[M－H]－離子，在電噴霧離子源負(fù)離子模式下易于被檢測(cè)。食醋的質(zhì)譜表明，在所有被測(cè)樣品中均能檢測(cè)到m/z164.9為[M－H]－離子的分子離子峰（圖1A）。為了確認(rèn)觀察到的成分是苯乳酸，采用半制備高效液相色譜純化鎮(zhèn)江香醋6 a陳醋樣品中的組分，并用1H-NMR（圖1B）和13C-NMR（圖1C）進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，化學(xué)位移為δ175.65的C1原子為羧基，C6化學(xué)位移轉(zhuǎn)移向低場(chǎng)（δ71.57）表明C6與羧基和羥基相連。質(zhì)子信號(hào)在δ6.5～8.0，碳化學(xué)位移在δ110～150之間，表明化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在苯環(huán)。C2在δ138.71中的化學(xué)位移與未取代的苯環(huán)（δ128.5）相比向低場(chǎng)移動(dòng)，對(duì)苯環(huán)中其他碳原子的化學(xué)位移沒有顯著影響，表明C2中苯環(huán)存在單取代基。C2的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)δ10.21，表明C2與CH2（40.15/2.97，2.79）相連。因此，化學(xué)結(jié)構(gòu)被鑒定為苯乳酸，結(jié)構(gòu)如圖1D所示，化學(xué)位移數(shù)據(jù)見表1。

圖1 食醋中苯乳酸的結(jié)構(gòu)鑒定圖Fig.1 Structural characterization of PLA in vinegar

表1 食醋中苯乳酸的NMR鑒定數(shù)據(jù)Table 1NMR data for PLA in vinegar

2.2 食醋中苯乳酸的高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

苯乳酸在中國(guó)食醋中是否常見以及含量多少尚不明確，因此有必要建立食醋中苯乳酸的檢測(cè)方法。用電噴霧離子源對(duì)苯乳酸進(jìn)行電離，并在MRM模式下進(jìn)行分析。離子模式為負(fù)離子模式，在全掃描模式下以[M－H]－作為苯乳酸的母離子，子離子掃描時(shí)選定豐度高并且穩(wěn)定的離子作定量離子。在MRM模式下優(yōu)化裂解電壓和碰撞能等參數(shù)，結(jié)果見表2。由圖2可知，苯乳酸出峰時(shí)間為3.11 min，峰單一無(wú)干擾，表明優(yōu)化的條件可用于苯乳酸的檢測(cè)。

表2 優(yōu)化的苯乳酸質(zhì)譜條件Table 2Optimal MS/MS conditions for the determination of PLA

圖2 食醋中苯乳酸的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of PLA in vinegar

2.2.2 色譜優(yōu)化

流動(dòng)相對(duì)苯乳酸的分離至關(guān)重要，因此篩選了乙腈溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸溶液、0.3%甲酸-乙腈溶液和0.3%甲酸溶液等流動(dòng)相進(jìn)行苯乳酸的分離。綜合考慮分析時(shí)間、峰形對(duì)稱度和離子豐度等因素，流動(dòng)相離子豐度最高的為0.3%甲酸溶液（A）和0.3%甲酸-乙腈溶液（B），梯度洗脫比等度洗脫效果好。優(yōu)化后的洗脫程序見1.3.3.1節(jié)。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.3.1 方法的線性范圍及檢出限

通過在模擬空白基質(zhì)（60 mg/L醋酸溶液）中添加苯乳酸（1、10、20、50、100、200、300、500 μg/L）的校準(zhǔn)曲線評(píng)估線性關(guān)系，如圖3所示。校正曲線的回歸方程表明，R2為0.999 8，線性良好。方法的基質(zhì)效應(yīng)為101.43%，表明食醋中苯乳酸檢測(cè)時(shí)，離子的增強(qiáng)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。根據(jù)RSN=3和RSN=10分別確定谷物醋中苯乳酸檢出限為0.6 mg/L，定量限為2 mg/L；白醋和果醋中苯乳酸檢出限為1.2 μg/L，定量限為4 μg/L。

圖3 苯乳酸在溶劑和模擬基質(zhì)中的校準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibration curves for PLA in solvent and simulated matrix

2.2.3.2 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

通過回收率考察方法的準(zhǔn)確度，如表3所示，方法平均回收率為82.1%～107.2%；通過分析重復(fù)性和再現(xiàn)性分析方法的精密度，即每個(gè)質(zhì)量濃度作3 個(gè)平行，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣5 次分析，計(jì)算平均回收率和RSD。同一個(gè)樣品于一天內(nèi)5 個(gè)不同時(shí)段進(jìn)樣分析，獲得日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d進(jìn)行測(cè)定，取平均值并計(jì)算RSD。日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.73%～4.30%和1.29%～4.99%，表明該方法具有較高的精度。利用MRM模式建立的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜方法具有較高的選擇性，與Ku?等[27]采用的氣相色譜-質(zhì)譜法相比，無(wú)需進(jìn)行酯化和萃取等繁瑣的處理，且僅對(duì)蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)處理。與吳仁蔚等[28]通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)77 種食醋中苯乳酸進(jìn)行測(cè)定的方法相比，一個(gè)樣品節(jié)省19 min，檢出限可達(dá)1.2 μg/L，單次運(yùn)行僅需6 min，與常用的高效液相色譜法單次運(yùn)行25 min相比，具有節(jié)省時(shí)間和溶劑的優(yōu)點(diǎn)[29]。此外，回收率測(cè)定結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度，重復(fù)性較好，證明了測(cè)定方法的可行性。因此，該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，適用于復(fù)雜食品基質(zhì)中苯乳酸的測(cè)定。

表3 食醋樣品中苯乳酸的加標(biāo)回收率（n=5）Table 3Recoveries of PLA spiked into vinegar samples (n= 5)

2.3 我國(guó)市售食醋中的苯乳酸含量分析

續(xù)表4

采用建立的方法分析我國(guó)72 種食醋樣品中的苯乳酸含量。除白醋和果醋外其他醋均屬于谷物醋，占我國(guó)市場(chǎng)所售食醋總量的95%以上。如表4、5所示，所有食醋中均含有苯乳酸，且原料種類對(duì)苯乳酸濃度有顯著影響。除白醋和果醋外，谷物醋中苯乳酸的平均質(zhì)量濃度為（227.89±145.50）mg/L，57.14%的食醋中苯乳酸質(zhì)量濃度高于200 mg/L，高于其他發(fā)酵食品如泡菜（49.5±5.0）mg/L、發(fā)酵乳（21.8±0.3）mg/L中苯乳酸含量[7,30]。食醋中苯乳酸的存在與乳酸菌有關(guān)，因?yàn)槿樗峋鞘炒装l(fā)酵過程中的主要菌種之一，乳酸菌發(fā)酵可以產(chǎn)生苯乳酸[31-32]。此外，據(jù)推測(cè)苯乳酸可能有助于提升食醋的風(fēng)味，類似現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)于薊蜜研究中，研究顯示薊蜜的風(fēng)味與苯乳酸純品的風(fēng)味密切相關(guān)[33]。該發(fā)現(xiàn)為乳酸菌對(duì)食醋發(fā)酵風(fēng)味和口感的提升提供了科學(xué)依據(jù)[18]。然而，醋酸菌對(duì)苯乳酸的產(chǎn)生是否有影響有待進(jìn)一步研究。此外，苯乳酸在谷物醋中的標(biāo)準(zhǔn)差為145.50 mg/L，表明在食醋中的含量變化范圍很大，造成差異的主要原因包括原料（稻米、糯米、高粱）、發(fā)酵方式（固態(tài)和液態(tài)深層發(fā)酵）、微生物和陳化時(shí)間等方面。

表4 谷物醋中苯乳酸含量Table 4Concentration of PLA in cereal vinegar

另一方面，白醋和果醋中苯乳酸含量極少，最高質(zhì)量濃度僅為（1.07±0.05）mg/L，推測(cè)與白醋特殊的生產(chǎn)工藝有關(guān)。我國(guó)白醋主要由醋酸菌發(fā)酵乙醇產(chǎn)生，包裝前經(jīng)過脫色處理，因此原材料中苯丙氨酸前體的缺乏限制了苯乳酸的合成[9]。此外，白醋制備中的脫色過程也會(huì)導(dǎo)致苯乳酸的損失。該發(fā)現(xiàn)與Giumanini等[34]關(guān)于蘋果醋的報(bào)道類似，即果汁原料中苯丙氨酸含量少是醋中苯乳酸含量低的主要原因。

2.4 生產(chǎn)工藝對(duì)谷物食醋中苯乳酸質(zhì)量濃度的影響

為了考察生產(chǎn)工藝對(duì)食醋中苯乳酸質(zhì)量濃度的影響，分別對(duì)原料、發(fā)酵方式和陳化時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示（圖4A），發(fā)酵方式是影響食醋中苯乳酸質(zhì)量濃度的關(guān)鍵因素，固態(tài)發(fā)酵食醋的苯乳酸平均質(zhì)量濃度比液態(tài)深層發(fā)酵高4.84 倍。原料對(duì)苯乳酸的質(zhì)量濃度也有顯著性差異（P＜0.05），以糯米為原料的食醋苯乳酸質(zhì)量濃度最高，為（398.36±98.17）mg/L；以稻米為原料的苯乳酸質(zhì)量濃度最低，為（92.05±102.05）mg/L。同樣，香醋、陳醋和米醋中苯乳酸含量具有顯著性差異（P＜0.05），香醋苯乳酸質(zhì)量濃度最高，其次是陳醋，最少的是米醋（圖4B）。另外，在陳化時(shí)間方面，從2 個(gè)品牌的4 個(gè)樣品中可以看出，陳化時(shí)間與苯乳酸質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。但由于樣本量小，比較的食醋可能來自不同的發(fā)酵批次，陳化時(shí)間的比較缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，陳化時(shí)間對(duì)苯乳酸質(zhì)量濃度的影響將實(shí)地工廠取樣進(jìn)一步研究。本研究所發(fā)現(xiàn)的發(fā)酵過程與苯乳酸含量的相關(guān)性可為食醋生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

圖4 生產(chǎn)工藝對(duì)食醋中苯乳酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation mode, raw material and vinegar type on the concentration of PLA in vinegar

2.5 苯乳酸與醋酸的聯(lián)合抑菌活性

鑒于食醋中苯乳酸含量難以達(dá)到抑菌效果，因此考察苯乳酸與醋酸的聯(lián)用抑菌效應(yīng)。如表6所示，苯乳酸MIC范圍為1.25～2.25 mg/mL，醋酸MIC在0.5～1.75 mg/mL之間，表明苯乳酸與醋酸抑菌效應(yīng)相當(dāng)。FICI為0.375～1，苯乳酸與醋酸對(duì)除銅綠假單胞菌外的其他食源性致病菌和腐敗菌均呈協(xié)同和部分協(xié)同抑菌作用，苯乳酸與醋酸共存時(shí)能增強(qiáng)苯乳酸的抑菌作用。

表6 苯乳酸與醋酸對(duì)食源性致病菌和腐敗菌的聯(lián)合抑菌作用Table 6Synergistic effect of PLA with acetic acid against foodborne pathogenic and spoilage bacteria

通過時(shí)間殺菌曲線和掃描電鏡考察苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的協(xié)同抑菌作用。如圖5所示，單獨(dú)使用苯乳酸（0.31 mg/mL）和醋酸（0.31 mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌均無(wú)抑制作用，而兩者聯(lián)用可完全抑制兩株菌的生長(zhǎng)，證實(shí)了苯乳酸和醋酸的協(xié)同抑菌效應(yīng)，同時(shí)也表明食醋中苯乳酸能夠通過與醋酸協(xié)同作用發(fā)揮抑菌活性。如圖6所示，未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞具有規(guī)則的球形形態(tài)和完整的細(xì)胞膜，單獨(dú)使用苯乳酸（1/4 MIC）和醋酸（1/2 MIC）處理的細(xì)胞有輕微皺褶和微量?jī)?nèi)容物滲漏，而苯乳酸（1/4 MIC）和醋酸（1/2 MIC）聯(lián)合處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，內(nèi)容物顯著泄露，說明苯乳酸和醋酸能夠協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞形態(tài)的破壞，且破壞程度與苯乳酸（MIC）和醋酸（MIC）相似。此外發(fā)現(xiàn)，苯乳酸和醋酸聯(lián)用處理的鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)更容易發(fā)生改變，外表面皺縮更為嚴(yán)重，但未有明顯的內(nèi)容物泄露。課題組基于苯乳酸和醋酸對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)[35]，兩者協(xié)同可以改變大腸桿菌的細(xì)胞表面電荷分布，消散細(xì)胞膜電勢(shì)，引起細(xì)胞發(fā)生形變，破壞基因組DNA從而發(fā)揮抑菌作用。而不同食源性致病菌和腐敗菌由于自身結(jié)構(gòu)不同而具有不同的抑菌方式，后續(xù)將進(jìn)一步研究苯乳酸和醋酸聯(lián)用對(duì)食源性致病菌和腐敗菌的抑菌機(jī)理。

圖5 苯乳酸和醋酸對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的時(shí)間殺菌曲線Fig.5 Time-kill curves of PLA and acetic acid against S.aureus and S.typhimurium

圖6 苯乳酸和醋酸對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌影響的掃描電鏡圖Fig.6 SEM micrographs of S.aureus and S.typhimurium treated with PLA and/or acetic acid

3 結(jié) 論

本研究建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食醋中苯乳酸的含量，并應(yīng)用該方法對(duì)72 種食醋進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有食醋中均含有苯乳酸。統(tǒng)計(jì)分析表明，原料和發(fā)酵方式對(duì)食醋中苯乳酸含量有顯著影響，以糯米為原料固態(tài)發(fā)酵制備的食醋中苯乳酸含量最高。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯乳酸與醋酸對(duì)大多數(shù)食源性致病菌和腐敗菌均具有協(xié)同抑菌作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯乳酸普遍存在于食醋中，其含量與食醋的生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，有利于食醋生產(chǎn)中的質(zhì)量控制；苯乳酸與醋酸具有協(xié)同抑菌作用，可為苯乳酸在食品生物防腐中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。