左乾程，黃永光,*，朱家合，馬菜飛

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州巖博酒業(yè)有限公司，貴州 盤州 553523）

白酒是我國傳統(tǒng)的民族特色飲料酒，釀造歷史悠久，是以酒曲（大曲、小曲或麩曲）為糖化發(fā)酵劑，將谷物類原料（高粱、大米、糯米、玉米等）通過糖化發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的蒸餾酒。因糖化發(fā)酵劑種類、發(fā)酵原料、釀造環(huán)境及生產(chǎn)工藝等因素的差異，中國白酒可分為醬香型、濃香型、清香型、米香型等多種香型[1]，以及近年發(fā)展起來的清醬香型[2]。清醬香型白酒釀造工藝過程有機融合了醬香型、清香型白酒釀造工藝之精華，以高粱為釀造原料，經(jīng)小曲、大曲糖化培菌、堆積發(fā)酵生香，再添加少數(shù)民族特色陀陀曲，多曲多方式科學應用，陶壇、窖池分型量質(zhì)發(fā)酵，與清香型、醬香型白酒釀造工藝最大的差別在于清醬香型白酒采用多曲聯(lián)用作為糖化發(fā)酵劑，不同于清香型白酒采用中溫大曲作為唯一糖化發(fā)酵劑、醬香型白酒采用高溫大曲作為唯一糖化發(fā)酵劑，因而形成了“清亮透明、清醬協(xié)調(diào)、香氣幽雅、香醇厚豐滿、細膩柔順、回味悠長”的酒體風格，既具有清香型白酒的幽雅凈爽，又具備醬香型白酒的醇厚豐滿，回味和空杯留香，深受大眾喜愛[3]。

白酒釀造屬于自然混菌固態(tài)發(fā)酵的過程，微生物貫穿始終，微生物主要來源于添加的糖化發(fā)酵劑（酒曲）、釀造環(huán)境，從某種程度來說，釀酒就是培養(yǎng)微生物并獲取其代謝產(chǎn)物的過程。釀酒微生物的群落結構及其演替決定了代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量，也就決定了白酒風味物質(zhì)的多樣性及組成，從而形成了白酒特定的口感和風格。清醬香型白酒酒體風格之所以區(qū)別于其他香型的白酒，除了其在釀造工藝上的創(chuàng)新與不同外，最根本的原因在于其獨特的發(fā)酵微生物群落結構和釀造環(huán)境。研究表明，細菌在白酒發(fā)酵過程中具有產(chǎn)酶及產(chǎn)香等功能[4]，其代謝產(chǎn)生豐富的風味物質(zhì)決定著白酒的風格及品質(zhì)[5-7]。因此，系統(tǒng)解析清醬香型白酒發(fā)酵過程細菌群落結構及其演替，有助于認識白酒發(fā)酵過程機理。

清醬香型白酒在入窖發(fā)酵前先進行薄層堆積發(fā)酵，堆積厚度為30 cm。堆積一方面是使曲中的微生物生長繁殖以擴大生物量，另一方面是為了網(wǎng)絡環(huán)境中豐富的釀酒微生物，為入池發(fā)酵奠定條件，環(huán)境微生物進入發(fā)酵體系主要取決于這個階段。眾所周知，白酒發(fā)酵過程微生物主要來源于酒曲及環(huán)境，釀造環(huán)境微生態(tài)是白酒發(fā)酵微生態(tài)的重要組成部分。早期對釀造環(huán)境中微生物的研究也日益增加，如曹達[8]對醬香型白酒釀造車間空氣中微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)不同高度空氣中微生物組成及含量存在差異；張良等[9]對瀘州老窖釀造車間細菌組成進行了研究，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌是空氣中的主要細菌。毫無疑問，這些研究對認識白酒釀造環(huán)境微生態(tài)結構及豐富白酒發(fā)酵微生態(tài)的科學認識具有重要意義，但以往研究集中在單一環(huán)境中微生物，且對微生物進入釀造體系的種類尚未可知。近年來研究者開始對白酒釀造過程微生物來源進行溯源分析，如Wang Xueshan等[10]對濃香型白酒發(fā)酵過程微生物進行溯源分析，發(fā)現(xiàn)大曲是濃香型白酒發(fā)酵過程中好氧菌和兼性厭氧菌的主要來源，窖泥是酒醅中厭氧微生物的主要來源，為釀酒微生物溯源分析奠定了基礎。

目前，清醬香型白酒還處在發(fā)展的初步階段，窖池發(fā)酵過程細菌群落結構尚不明確，酒曲及環(huán)境微生物對堆積發(fā)酵的貢獻尚不清晰，在一定程度上制約了清醬香型白酒的發(fā)展。因此，為解析清醬香型白酒釀造發(fā)酵過程中的細菌來源，本研究對釀造環(huán)境微生物、釀造用曲的微生物、堆積發(fā)酵酒醅微生物、窖池發(fā)酵酒醅微生物進行比較分析，擬進一步揭示釀造過程微生物的不同來源及其對白酒發(fā)酵的貢獻。本研究采用高通量測序技術及數(shù)理統(tǒng)計分析，對清醬香型白酒發(fā)酵過程細菌群落結構及其演替進行解析，并初步分析酒曲及環(huán)境中微生物對堆積發(fā)酵的貢獻，對認識固態(tài)法白酒釀造的發(fā)酵機制，提升清醬香型白酒的產(chǎn)品質(zhì)量、安全性及生產(chǎn)可控性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酒醅：樣品采自貴州YB酒業(yè)有限公司窖池發(fā)酵生產(chǎn)車間2019年11—12月生產(chǎn)發(fā)酵酒醅，入池前先進行2 d的薄層堆積發(fā)酵，窖池發(fā)酵周期為25 d，選擇0、5、10、15、20、25 d為取樣時間點。每個取樣時間點分別采集酒醅上層、中層以及底層3 個層次的樣品，每個層面分別采集中間及四周邊緣位置（圖1A）混合后作為窖池一個層面的酒醅樣。然后將3 個層面所取酒醅混合均勻后作為一個樣以消除取樣誤差，混勻后立即用無菌密封袋包裝，樣品采集完成后立即進行DNA的提取和理化指標分析。

圖1 窖池發(fā)酵及堆積酒醅取樣圖Fig.1 Sampling locations of fermented grains from cellar and fermented grains with and without koji

曲：采集上述發(fā)酵開始時添加的曲粉樣品，從曲粉袋中隨機取500 g混合的曲粉樣品，取樣完成后立即進行總DNA的提取。

環(huán)境綜合樣品：為了說明堆積發(fā)酵過程酒醅中細菌來源，設計不添加曲的堆積樣品實驗作為對照，該樣品作為環(huán)境綜合樣品，用以說明環(huán)境微生物對堆積發(fā)酵過程的影響。具體做法：在距離正常添加酒曲堆積發(fā)酵的酒醅（圖1B）2 m處設置相同的堆積酒醅（圖1C），除了不添加酒曲外，其他條件（釀酒原料、堆子形狀、堆積時間、操作步驟等）均與正常添加酒曲堆積酒醅一致，堆積2 d后進行采樣，采樣點與窖池采樣點一致，采集上、中、下3 個層面的樣品，每個層面采集5 個點，將3 個層面樣品混勻后立即用無菌自封袋密封，采集完成后即刻進行DNA提取。

1.1.2 試劑

瓊脂糖凝膠 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Gengreen核酸染料 天根生化科技（北京）有限公司；E.Z.N.A.?soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；無菌磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

Heraeus Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機、Evolution200紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；HQ-60-II漩渦混合器 北京北方同正生物技術發(fā)展有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；CP153電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；PB-10 pH計 德國Sartorius集團；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理及DNA提取[10-13]

分別稱取1.1.1節(jié)采集的酒醅樣品、混合曲粉樣品及環(huán)境樣品10 g于無菌離心管中，加入20 mL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）及3 顆玻璃珠864.7 mg（直徑為0.1 mm），渦旋振蕩7 min，于室溫、400 r/min離心5 min，收集上清液，用PBS洗滌沉淀，渦旋振蕩6 min，于室溫、400 r/min離心6 min，吸取上清液，繼續(xù)用PBS洗滌沉淀，渦旋振蕩4 min，400 r/min離心6 min，收集上清液。將3 次收集的上清液充分混勻后于室溫、12 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，收集細胞沉淀。預處理完成后，參照E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明書進行樣品總DNA的提取。

1.3.2 PCR擴增及Illumina MiSeq測序

應用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對大曲基因組進行擴增[12]，PCR體系及反應條件參考黃蘊利等[14]的方法，并適當修改，PCR體系：10×Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，正反應物各0.8 mL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL，共計20 μL反應體系。PCR條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，27 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。凝膠電泳：1 g/100 mL瓊脂糖凝膠，核酸染料，電壓90 V，電泳時間40 min。高通量測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

1.3.3 理化指標測定

酒醅溫度測定：取樣的同時將溫度計插入取樣點，保持1～5 min，待讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄溫度計溫度數(shù)據(jù)。水分的測定采用烘干法；酸度的測定采用酸堿滴定法，以1 g酒醅消耗0.1 mol/L的NaOH溶液體積表示；還原糖的測定采用斐林試劑法。具體操作參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》[15]。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程酒醅理化指標變化規(guī)律

發(fā)酵過程酒醅理化參數(shù)（溫度、水分、酸度、還原糖等）是影響微生物群落結構演替的重要因素。由表1可知，發(fā)酵開始（0 d）時酒醅溫度為（22.3±0.3）℃，發(fā)酵5 d后達到最大值，是由于發(fā)酵前期微生物生長繁殖產(chǎn)生的生物熱所導致，之后呈下降趨勢，主要原因是隨著發(fā)酵的進行，酒醅中微生物數(shù)量下降，故而產(chǎn)生的熱量降低所致。酒醅水分與還原糖則呈波動式變化。發(fā)酵過程酒醅酸度一直呈降低趨勢，且在10～15 d階段下降最快，主要是微生物代謝的結果，理化參數(shù)在影響微生物群落演替的同時也受微生物代謝影響。

表1 發(fā)酵過程理化指標變化規(guī)律Table 1Changes in physicochemical indicators during fermentation

2.2 α多樣性分析

Shannon指數(shù)和OTU數(shù)目常用來評價微生物群落的物種多樣性，Shannon指數(shù)及OTU數(shù)目越大，代表微生物多樣性越高；Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來表征微生物群落的物種豐富度，Chao1指數(shù)越大，代表微生物群落物種豐富度越高，Simpson指數(shù)越大，代表微生物群落物種豐富度越低。如表2所示，發(fā)酵開始（0 d）時酒醅中細菌的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)最高，Simpson指數(shù)最低，表明此時酒醅中細菌物種多樣性及豐富度最高，這是堆積過程曲中細菌增殖及網(wǎng)絡環(huán)境中微生物的結果，該現(xiàn)象說明堆積發(fā)酵對清醬香型白酒釀造的重要意義，不僅能提高的微生物多樣性，而且能增加微生物種類豐富度。0～20 d，細菌的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)呈降低趨勢，Simpson指數(shù)呈升高趨勢；20～25 d，細菌群落的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)出現(xiàn)部分升高，而Simpson指數(shù)出現(xiàn)部分降低。這說明在發(fā)酵過程中細菌群落的多樣性及豐富度先降低后升高，總體上呈降低趨勢。此外，從發(fā)酵5 d開始，酒醅中細菌群落的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)目、Chao1及Simpson指數(shù)產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.05），發(fā)酵10 d開始，酒醅中細菌群落的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)目、Chao1及Simpson指數(shù)產(chǎn)生極顯著性差異（P＜0.05），說明發(fā)酵過程細菌群落結構的顯著變化。

表2 酒醅細菌群落的α多樣性指數(shù)Table 2Alpha-diversity indexes of bacterial community in fermented grains

2.3 發(fā)酵過程細菌群落結構分析

從清醬香型白酒發(fā)酵過程中共檢出14 個菌門，其中相對豐度大于0.1%的有Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、Epsilonbacteraeota、Verrucomicrobia及Patescibacteria（圖2）。發(fā)酵開始（0 d）時，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria及Cyanobacteria 3 個菌門在酒醅中占主導地位，平均相對豐度大于10%，這與醬香型白酒、清香型白酒發(fā)酵過程主導菌門有所區(qū)別，胡小霞等[16]通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)醬香型白酒發(fā)酵過程僅Firmicutes、Proteobacteria 2 個門占主導地位，平均相對豐度均大于10%。王雪山[17]通過高通量測序分析清香型白酒發(fā)酵過程同樣發(fā)現(xiàn)僅Firmicutes、Proteobacteria 2 個門占主導地位，平均相對豐度均大于10%。此外，圖2表明：發(fā)酵5 d之后，F(xiàn)irmicutes在酒醅中占絕對主導地位，相對豐度高達88.00%～99.36%。該結果與醬香型白酒[16]、清香型白酒[17]、濃香型白酒[18]、芝麻香型白酒[19]研究結論一致，表明在白酒發(fā)酵過程中，細菌門水平群落多樣性降低，發(fā)酵微生態(tài)結構由多菌系演替為單一的Firmicutes為主導的發(fā)酵模式是白酒釀造發(fā)酵的普遍模式。

圖2 門水平酒醅中細菌種群演替規(guī)律Fig.2 Succession of bacterial community structure in fermented grains at the phylum level

從清醬香型白酒發(fā)酵過程中共檢出113 個細菌屬，其中平均相對豐度前10為Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Gluconobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus（圖3），分別均占每個樣品相對豐度的94.15%～99.94%。發(fā)酵開始（0 d）時，酒醅中Bacillus相對豐度最高（49.11%），依次是Weissella（12.05%）、Acetobacter（10.63%）、Gluconobacter（8.85%）、Pediococcus（3.27%）、Scopulibacillus（1.91%）、Enterobacter（1.61%）、Staphylococcus（1.50%）、Kroppenstedtia（1.50%）。發(fā)酵5 d后，Lactobacillus在酒醅中占主導作用，相對豐度為78.86%。而Bacillus相對豐度陡然降低至3.94%，Acetobacter、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus也呈降低趨勢。發(fā)酵10 d后，Lactobacillus在酒醅中占絕對主導作用，相對豐度高達96.68%～98.48%。該結果與清香型白酒[17,20]、醬香型白酒[5,16]、芝麻香型白酒[19,21]、濃香型白酒[22]研究結論一致，表明白酒發(fā)酵過程中，細菌屬水平群落多樣性降低，微生態(tài)結構由多菌系演替為單一的Lactobacillus為主導的發(fā)酵模式是白酒發(fā)酵的普遍模式。

圖3 屬水平酒醅中細菌種群演替規(guī)律Fig.3 Succession of bacterial community structure in fermented grains at the genus level

上述10 個菌屬中，Lactobacillus、Bacillus、Weissella在多種香型白酒發(fā)酵過程都有報道[16-17,19-21]，是傳統(tǒng)白酒釀造的主要功能細菌屬。其中，Bacillus可代謝產(chǎn)生糖化酶、蛋白酶等多種水解酶類，同時還可代謝產(chǎn)生乙偶姻、4-甲基吡嗪等風味物質(zhì)[23-25]，對白酒的風味品質(zhì)具有重要貢獻。Lactobacillus和Weissella在發(fā)酵過程可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸類物質(zhì)，為白酒中風味物質(zhì)的生物合成提供前體物[5,20]，同時也是造成發(fā)酵環(huán)境酸度升高（表1）的主要原因之一。Acetobacter和Gluconobacter屬于醋酸菌[26]，在白酒發(fā)酵過程能將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，為白酒中風味物質(zhì)合成提供前體；Pediococcus屬于乳酸菌，在發(fā)酵過程中也能代謝產(chǎn)生乳酸等有機酸。

高通量測序結果表明，清醬香型白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%）為Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Gluconobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus。據(jù)報道，清香型白酒中發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%）是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter[12,27-28]，醬香型白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%）為Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmosporr[5,29-30]。其中，Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus是清醬香型白酒和清香型白酒發(fā)酵中共有的優(yōu)勢細菌屬，而Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Weissella、Enterobacter是清醬香型白酒和醬香型白酒發(fā)酵中共有的優(yōu)勢細菌屬。此外，與醬香型白酒和清香型白酒發(fā)酵中優(yōu)勢細菌屬相比，Gluconobacter是清醬香型白酒發(fā)酵中獨有的優(yōu)勢細菌屬，該菌屬在白酒釀造中的作用及對白酒風味的貢獻尚不清晰。以上結果表明：清醬香型白酒發(fā)酵優(yōu)勢細菌屬除具有清香型和醬香型白酒發(fā)酵的優(yōu)勢細菌屬特征外，還具有自身的特有的優(yōu)勢細菌屬。這也是清醬香型白酒酒體風格除了具有清香型、醬香型白酒的酒體風格特征外，還具備清醬香型白酒自身風格特點的原因之一。

2.4 發(fā)酵過程細菌群落結構與環(huán)境因素相關性

發(fā)酵過程酒醅的環(huán)境因子會影響微生物群落結構演替，以此探究環(huán)境因子對細菌群落結構的影響可為調(diào)整白酒生產(chǎn)過程理化參數(shù)及提高生產(chǎn)可控性提供理論依據(jù)。RDA結果表明，酒醅溫度（對細菌群落結構貢獻率為22.56%，P＜0.05）、水分（對細菌群落結構貢獻率為17.5%，P＜0.05）、酸度（對細菌群落結構貢獻率為16.8%，P＜0.05）及還原糖含量（對細菌群落結構貢獻率為15.3%，P＜0.05）與細菌群落結構均存在顯著相關，其中還原糖含量與溫度、水分及酸度負相關（環(huán)境因子間的夾角為鈍角），而與溫度、水分、酸度之間正相關（環(huán)境因子間的夾角為銳角）。發(fā)酵開始時（0 d）時，酒醅中細菌群落結構受還原糖影響較大（還原糖含量對細菌群落結構貢獻率為38.97%），這是因為發(fā)酵前期酒醅中微生物生長繁殖需要消耗較多的還原糖，發(fā)酵5 d之后，還原糖對細菌群落結構影響不大，這是因為這個階段主要是乙醇發(fā)酵及產(chǎn)香階段，微生物將前期產(chǎn)生的小分子化合物轉(zhuǎn)化為乙醇及其他風味物質(zhì)，還原糖濃度降低，因此受還原糖含量影響不大。發(fā)酵中后期（10～25 d）細菌群落結構主要受酸度的影響，該階段細菌群落結構以Lactobacillus為主導，Lactobacillus會代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸，對細菌群落結構造成重要影響。如圖4B所示，熱圖中的X軸和Y軸分別為環(huán)境因子和物種（屬水平），通過計算獲得R值和P值考察2 個（組）變量之間的相關程度。除乳酸菌與酸度高度顯著正相關外，其他優(yōu)勢菌屬幾乎與酒醅酸度呈顯著負相關，導致其他菌群結構豐度降低。Lactobacillus代謝產(chǎn)生的乳酸等有機酸，一方面可以為白酒中風味物質(zhì)的合成提供前體，另一方面可以抑制不耐酸雜菌的生長，從而保證發(fā)酵正常進行。溫度、還原糖幾乎與所有優(yōu)勢菌屬呈顯著正相關，表明當前酒醅的溫度及還原糖含量比較適宜微生物生長，不會對其造成抑制作用。水分與Bacillus、Weissella、Pediococcus、Staphylococcus、Scopulibacillus顯著負相關，表明酒醅水分增加會對這些菌屬生長造成抑制，也是這些菌屬豐度降低的原因之一。

圖4 發(fā)酵過程中細菌群落結構與酒醅理化因子相關性分析Fig.4 Correlation between bacterial community structure and physicochemical properties of fermented grains during fermentation

2.5 堆積發(fā)酵過程細菌群落結構主要來源分析

如圖5A所示，環(huán)境樣品（不添加酒曲）中優(yōu)勢細菌門與酒醅中（發(fā)酵0 d）優(yōu)勢菌門結構高度相似，表明環(huán)境微生物對白酒發(fā)酵具有重要貢獻，這是長期釀造活動對釀造環(huán)境微生物的富集和結構優(yōu)化的結果。酒醅及環(huán)境樣品中都是Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria占主導地位，而酒曲中是Actinobacteria及Firmicutes占主導，推測酒醅中Cyanobacteria主要來自于環(huán)境。如圖5B所示，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes 5 個菌門在酒醅、環(huán)境及酒曲都能檢測到，而Fusobacteria僅在環(huán)境樣品中檢測到，同時該菌門在酒醅樣品中被檢測到，推測酒醅中的Fusobacteria僅來源于環(huán)境。此外，Chloroflexi和Verrucomicrobia 2 個菌門僅在酒曲中被檢測，同時這2 個菌門在酒醅中能檢測到，推測這2 個菌門僅由酒曲提供。

圖5 酒醅、酒曲及環(huán)境樣品中細菌門水平的種群分布結構Fig.5 Bacterial community structure in fermented grains, koji and environmental samples at the phylum level

圖6A展示了酒醅、酒曲及環(huán)境中共有及特有的細菌屬數(shù)，結果顯示酒醅中共有19 個細菌屬來自于環(huán)境，占比為31.67%，有30 個屬來自于酒曲，占比為50%，其中，有16 個屬由酒曲及環(huán)境共同提供，占比為26.67%。此外，有3 個細菌屬僅在酒醅及環(huán)境中檢測到，占比為5%，推測該3 個菌屬僅來自于環(huán)境；此外，有14 個細菌屬僅在酒醅及酒曲中檢測到，占比為23.33%，推測這14 個細菌屬僅來自酒曲中。同時通過優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%）分析，發(fā)現(xiàn)釀造環(huán)境中存在大量的白酒發(fā)酵功能細菌（圖6B），如Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter等，而且環(huán)境中優(yōu)勢細菌屬與酒醅中優(yōu)勢細菌具有較高的相似性，說明在堆積發(fā)酵過程網(wǎng)絡了大量環(huán)境中的功能優(yōu)勢細菌屬，進而論證了薄層堆積發(fā)酵對清醬香型白酒發(fā)酵的重要作用。此外，酒醅中的優(yōu)勢細菌屬Gluconobacter僅在環(huán)境中被檢測，推測該菌屬僅由環(huán)境提供。

圖6 酒醅、酒曲及環(huán)境樣品中細菌屬水平種群結構分布Fig.6 Bacterial community structure in fermented grains, koji and environmental samples at the genus level

3 結 論

本研究應用高通量測序及統(tǒng)計分析方法對清醬香型白酒窖池發(fā)酵過程中的細菌群落結構進行解析，共檢出14 個菌門，113 個菌屬。發(fā)酵開始（0 d）時，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria及Cyanobacteria在酒醅中占主導地位，平均相對豐度均大于10%，隨著發(fā)酵的進行，逐漸演替為單一的Firmicutes為主導。發(fā)酵過程相對豐度前10的細菌屬為Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Gluconobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus。隨著發(fā)酵的進行，逐漸演替為單一的Lactobacillus為主導。通過與清香型、醬香型白酒釀造過程優(yōu)勢細菌屬對比，清醬香型白酒釀造過程的細菌群落結構與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性，但又有不同于典型的清香型和醬香型白酒釀造過程的細菌群落結構，具有其自身獨特性。通過主要優(yōu)勢菌與環(huán)境因子相關性分析發(fā)現(xiàn)，除了Lactobacillus，大部分優(yōu)勢菌屬都與酒醅酸度呈顯著負相關，這是發(fā)酵后期Lactobacillus占絕對主導地位的主要原因。

通過分析比較酒醅樣品（發(fā)酵0 d）、酒曲、環(huán)境樣品（不添加大曲堆積酒醅）之間的細菌群落結構以說明酒醅中的細菌來源，結果表明門水平上酒醅中 Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes由大曲及環(huán)境提供，Cyanobacteria主要來自于環(huán)境，F(xiàn)usobacteria僅由環(huán)境提供，Chloroflexi和Verrucomicrobia僅來自于大曲。屬水平上酒醅中的細菌屬有31.67%來自于環(huán)境，50%來自于酒曲，23.33%由酒曲及環(huán)境共同提供，5%只由環(huán)境提供。優(yōu)勢細菌屬中Gluconobacter僅來自于環(huán)境。本研究系統(tǒng)解析了清醬香型白酒窖池發(fā)酵過程細菌群落結構，初步分析了堆積發(fā)酵過程酒醅中細菌來源，有助于完善白酒發(fā)酵微生態(tài)結構的研究，并對提升白酒產(chǎn)品質(zhì)量、安全及生產(chǎn)可控性具有重要的意義。