夏 歡 高 華 王玉玲 羅 琴 楊新玲

(1 新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，烏魯木齊市 830011，電子郵箱：xiahuanle3827@163.com；2 新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊市 830011； 3 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)科VIP一病區(qū)，烏魯木齊市 830054； 4 新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院呼吸和神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊市 830011； 5 新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊市 830063)

帕金森病是以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性、死亡為特征的神經(jīng)變性疾病,臨床上主要采用美多芭聯(lián)合普拉克索治療改善患者的癥狀[1]。Fas廣泛表達于各種上皮細胞，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)細胞及免疫細胞，而Fas配體屬于1型膜蛋白，被稱作“死亡受體”，通常只表達于激活的成熟CD4+、CD8+T細胞、B細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞表面[2]。既往研究提示Fas與配體結(jié)合可誘導表達Fas的細胞出現(xiàn)凋亡，這個過程與乳腺癌、阿爾茲海默病等多種疾病的發(fā)生有關[3-4]。Fas基因是否與帕金森病的發(fā)生和發(fā)展存在關聯(lián)是近年來研究的熱點[5]。本研究以帕金森病患者和帕金森病大鼠模型為研究對象，探討Fas介導的細胞凋亡在帕金森病發(fā)病中的機制。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 實驗動物：無特定病原體級雄性SD大鼠45只，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，體重(200±20)g，6～8周齡，實驗動物在無特定病原體級動物實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為(23±2)℃，相對濕度為45%～80%。

1.1.2 實驗分組與模型建立：將45只大鼠按隨機數(shù)字法分為空白對照組、帕金森病組、Fas 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)組，每組15只?？瞻讓φ战M大鼠于左側(cè)腦黑質(zhì)內(nèi)注入生理鹽水3 μL；帕金森病組大鼠參考相關文獻[6-7]進行定位及建立帕金森模型，用4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上，將5 μg/μL 6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA，美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：162957)3 μL注射到大鼠于左內(nèi)側(cè)前腦束區(qū)。2周后于大鼠頸背部皮下注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，誘發(fā)旋轉(zhuǎn)運動，記錄30 min的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，將旋轉(zhuǎn)速度為7 r/min 以上的左旋鼠視為早期帕金森病大鼠模型建模成功；Fas siRNA組大鼠于左側(cè)腦黑質(zhì)內(nèi)注入Fas siRNA(由武漢萊康生物有限公司設計合成) 3 μL(1.0 nmol/L)，2 d后同側(cè)再注入同等計量6-OHDA，2周后檢測相關指標。

1.1.3 免疫組化檢測陽性多巴胺細胞數(shù)：干預2周后腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)后處死大鼠，取左側(cè)中腦組織塊行5 μm厚冠狀連續(xù)冷凍切片，滴加正常山羊血清封閉液后，分別加入酪氨酸羥化酶一抗(美國Santa Cruz公司)，室溫放置5 min后4℃冰箱過夜，滴加人辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)反應20 min，然后磷酸緩沖鹽溶液洗3次，5 min/次，最后加入新配的二氨基聯(lián)苯胺，于顯微鏡下顯色，蘇木素復染細胞核，封膠后顯微鏡下觀察。

1.1.4 PCR檢測細胞Fas mRNA表達量：處死大鼠后取出左側(cè)中腦，加入2 mL TRIzol試劑提取總RNA。使用紫外分光光讀法檢測RNA濃度和純度，確定RNA的A260/280在1.8～2.0之間，并稀釋到300～500 ng/μL。按照MicroPoly(A)Pure試劑盒(美國Ambion公司，批號：4368814)使用說明進行反轉(zhuǎn)錄反應，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進行PCR擴增。20 μL反應體系包括2 μg RNA、1 μL OligodT(加水至11 μL，70℃水浴10 min后冰上冷卻)，0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL RNA酶抑制劑，1～2 μL dNTP，補充buffer緩沖液至20 μL。以β-肌動蛋白作為管家基因。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57.4℃條件下退火30 s，72℃延伸30 s，共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸15 min。PCR的檢測儀器為Bioanalyzer 2100(美國Agilent公司，型號：G2939A)。從GenBank中檢索大鼠Fas全長cDNA序列(Gene ID 246097)，參考Song等[8]設計Fas 引物，F(xiàn)as 引物正向序列為5′-GGAUUAUAUCAAGGAGGCCdTdT-3′，反向序列為5′-GGCCUCCUUGAUAUAAUCCdTdT-3′(武漢萊康生物科技有限公司合成)。β-肌動蛋白引物正向序列：5′-TCACCAACTGGGACGACAT-3′，反向序列：5′-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。采用 2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量,△△Ct=△Ct(目的基因)-△Ct(β-肌動蛋白)，△△Ct= △Ct(實驗樣本)-△Ct(對照樣本)。

1.2 臨床研究 將2016年9月至2018年12月在新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科專家門診就診的153例帕金森病患者作為病例組，診斷均符合《中國帕金森病診斷標準(2016版)》[9]，排除腦血管疾病、腦炎、外傷、藥物等所致的帕金森綜合征以及帕金森疊加綜合征、其他患有嚴重全身疾病的患者。其中男性91例、女性62例，年齡(63.14±8.45)歲。根據(jù)Hoehn-Yahr分級標準[10]，將有單側(cè)肢體或雙側(cè)肢體癥狀，但無平衡障礙者作為輕度患者；有雙側(cè)肢體癥狀且存在平衡障礙，但保留獨立能力作為中度患者；有嚴重肢體障礙無獨立生活能力，但在無協(xié)助的情況下仍能行走或站立，或須在輪椅或床上，需人照料作為重度患者。再選取來自相同地區(qū)無帕金森病臨床表現(xiàn)和帕金森病家族史的177例健康體檢者作為對照組，其中男性109例、女性68例，年齡(61.35±9.50)歲。兩組研究對象一般資料差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。抽取研究對象空腹靜脈血2 mL至乙二胺四乙酸抗凝管中，采用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(美國Santa Cruz公司，批號：sc-8009)檢測可溶性Fas(soluble Fas，sFas)和可溶性Fas配體(soluble Fas ligand，sFasL)水平，參考說明書進行操作。

表1 病例組與對照組一般資料的比較

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析,方差不齊時采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；連續(xù)變量相關性采用Pearson檢驗，等級資料的相關性采用Spearman非參數(shù)相關分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠旋轉(zhuǎn)行為發(fā)生情況 空白對照組大鼠未觀察到旋轉(zhuǎn)行為，帕金森病組和Fas siRNA組平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7 r/min的大鼠分別為14和7只，F(xiàn)as siRNA組大鼠旋轉(zhuǎn)率較帕金森病組減少(χ2=5.714，P=0.005)。

2.2 3組大鼠陽性多巴胺細胞數(shù)和Fas mRNA表達情況 免疫組化結(jié)果顯示，400倍視野下表達酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性的多巴胺細胞表現(xiàn)為胞漿被染色呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，細胞形態(tài)也略顯狹長，見圖1。空白對照組、Fas siRNA組、帕金森病組TH陽性細胞計數(shù)依次減少(均P<0.05)，見表2。PCR結(jié)果顯示，空白對照組、Fas siRNA組、帕金森病組的Fas mRNA表達水平依次升高(均P<0.05)，見表2。

圖1 3組大鼠腦組織TH陽性細胞(400×)

表2 3組TH陽性細胞計數(shù)和FasmRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.3 3組大鼠Fas mRNA表達水平與TH陽性細胞計數(shù)的相關性 相關性分析結(jié)果顯示，帕金森病組與Fas siRNA組Fas mRNA表達水平與TH陽性細胞呈負相關性(r=-0.342，P=0.022；r=-0.514，P=0.003)，空白對照組Fas mRNA表達水平與TH陽性細胞數(shù)無相關性(r=0.066，P=0.354)。

2.4 不同病情程度患者與對照組sFas和sFasL水平的比較 153例帕金森病患者中，輕度21例，中度85例，重度47例。4組sFas和sFasL水平比較差異具有統(tǒng)計學意義，其中中度組和重度組sFas和sFasL水平均高于對照組和輕度組，且重度組以上指標水平均高于中度組(均P<0.05)，見表3。相關分析結(jié)果顯示，帕金森病患者sFas和sFasL水平均與Hoehn-Yahr分級成正相關(r=0.822、0.723，均P<0.001)。

表3 不同病情程度患者與對照組外周血sFas和sFasL水平的比較(x±s，ng/L)

3 討 論

帕金森病是中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其基本病理特征是Lewy小體的形成、黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，導致多巴胺遞質(zhì)減少，累積到一定程度后可導致帕金森病的發(fā)生，從而引起錐體外系運動功能障礙。免疫異常導致的黑質(zhì)和紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡、外周血淋巴細胞數(shù)量減少在帕金森病的發(fā)病機制中所起的作用，成為近年來研究的熱點。而隨著研究的不斷深入，Blennow等[11]在帕金森病患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)抗多巴胺神經(jīng)元抗體，免疫異常導致的細胞凋亡學說在帕金森病的發(fā)病機制中所起的作用開始受到學者的重視[12]。隨后的細胞、動物模型實驗以及人體尸檢都證明免疫異常導致的細胞凋亡參與了帕金森病的發(fā)生及進展[13]。死亡受體凋亡通路，主要由死亡受體介導并直接激活合半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-8，而Caspase-8是死亡受體凋亡通路中重要的啟動者，起著中心調(diào)控作用，如果Caspase-8失活，即使細胞色素C發(fā)揮“扣動扳機”的作用也無法引起細胞凋亡的發(fā)生[14]。Fas是一種存在于細胞表面、分子量為48kD的跨膜蛋白分子,包含膜內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及膜外區(qū)三部分，其膜內(nèi)存在由80個氨基酸序列組成的死亡域，該域是介導凋亡的功能區(qū)。Fas配體亦屬于腫瘤壞死因子超家族，與死亡受體Fas結(jié)合后，就會引起Fas-Fas配體-Caspase-8反應，活化的Caspase-8進一步激活Caspase-3、7、9、10等，引起細胞凋亡的發(fā)生[15-16]。因此，理論上阻斷外部凋亡通路可以阻止帕金森病的發(fā)生或延緩其進展。

本研究的動物實驗結(jié)果顯示，帕金森病組大鼠腦組織黑質(zhì)Fas mRNA的表達水平高于空白對照組，提示Fas可能參與了帕金森的發(fā)病機制。而免疫組織化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)as siRNA組、帕金森病組的TH陽性細胞計數(shù)較空白對照組減少，但Fas siRNA組TH陽性細胞計數(shù)多于帕金森病組，提示阻斷Fas基因表達后，能夠有效抑制多巴胺能神經(jīng)元細胞的凋亡。且相關性分析顯示，帕金森病組和Fas siRNA組Fas mRNA表達水平與TH陽性細胞數(shù)呈負相關性，即隨著Fas基因表達的增加，TH陽性細胞呈下降趨勢。提示Fas參與抑制多巴胺能神經(jīng)元可能與Fas基因的表達有關。而Fas是Fas-Fas配體-Caspase-8凋亡途徑中重要的啟動因子，因此，進一步推測在帕金森病的發(fā)病機制中，F(xiàn)as可能通過過度表達的方式促進多巴胺能神經(jīng)元凋亡。Ferrer等[17]的研究結(jié)果顯示帕金森病患者腦組織的反應性星形細胞中Fas/Fas配體表達升高。還有研究顯示，在帕金森病小鼠模型中，F(xiàn)as凋亡抑制分子2 (Fas-apoptotic inhibitory molecule 2，F(xiàn)aim2)對多巴胺能神經(jīng)元具有保護作用，缺乏Faim2的卒中和細菌性腦膜炎的小鼠出現(xiàn)神經(jīng)退行性變表現(xiàn)，而且Faim2缺陷型小鼠多巴胺能神經(jīng)元減少53%[18]。這表明Fas誘導的凋亡是導致小鼠多巴胺能神經(jīng)元死亡的重要病理機制。Jiang 等[19]發(fā)現(xiàn)丁苯酞對1-甲基-4苯基-吡啶離子誘導的帕金森病大鼠模型細胞凋亡具有一定抑制作用，其機制可能是通過調(diào)節(jié)死亡受體途徑上Fas的表達，抑制細胞凋亡來實現(xiàn)的。

Fas廣泛表達于各種上皮細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及免疫細胞中。尸檢結(jié)果顯示帕金森病患者腦內(nèi)星形細胞Fas和Fas配體表達增高，sFas和sFasL分別作為Fas和Fas配體的活性功能分子，可溶于外周血中。sFas可與Fas競爭Fas配體，但并不引起凋亡，具有調(diào)節(jié)Fas的功能。而sFasL是膜相Fas配體經(jīng)酶水解后的可溶性細胞因子，能夠到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮遠端效應。這兩種分子可能就是中樞與外周之間的“信使”，通過發(fā)揮信息的傳遞作用參與了帕金森病的發(fā)生與發(fā)展[20]。因此，檢測外周血sFas和sFasL水平可以了解帕金森病的發(fā)生和發(fā)展情況。本研究的臨床研究顯示，帕金森病患者外周血sFas和sFasL水平均高于對照組，提示血sFas和sFasL可能參與帕金森病發(fā)生和發(fā)展的過程。相關分析結(jié)果顯示，Hoehn-Yahr分級與帕金森病患者外周血sFas和sFasL水平呈正相關，提示帕金森病患者外周血sFas/sFasL不僅參與免疫異常，而且與疾病的嚴重程度有關。

帕金森病是一種神經(jīng)變性疾病，與神經(jīng)細胞凋亡有關，但細胞凋亡是一個復雜的過程，而多種因素可造成中腦黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元凋亡。帕金森大鼠Fas表達升高，F(xiàn)as過表達介導的信號凋亡通路可能是帕金森病重要的發(fā)病機制之一；通過抑制Fas的表達從而抑制細胞凋亡，或可延緩帕金森病進程，從而達到有效治療帕金森病的目的。