劉倩 白建民

(南陽醫(yī)學高等?？茖W校護理系，河南 南陽 473000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的重要原因之一，臨床上其主要病理特征之一為腎小球足細胞損傷，在DN的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用〔1〕。miRNA在腎臟發(fā)育、平衡和疾病中具有重要作用，與腎小管間質硬化和終末期腎小球病變的發(fā)生相關；可作為腎病的一種新的診斷標志物和治療靶點〔2〕。miR-99a通過靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)2基因可調節(jié)大鼠間充質干細胞的早期軟骨形成分化〔3〕；miR-99a-3p的異位表達能顯著抑制癌細胞在前列腺癌(PCa)細胞中的增殖、遷移和侵襲〔4〕。分化抗原(CD)36是清道夫受體家族成員之一，是巨噬細胞吞噬脂質的主要受體，與多種配體相結合可介導先天性免疫及炎癥等〔5〕。CD36在乙酰氨基酚誘導的肝損傷中通過促進肝臟炎性反應及促進細胞凋亡發(fā)揮促進炎癥應答的作用〔6〕；CD36也與2型糖尿病的發(fā)病有關，高糖環(huán)境可上調CD36的表達，CD36單核苷酸多態(tài)性與胰島素抵抗密切相關〔7〕。但miR-99a-3p在高糖誘導的小鼠足細胞損傷中的表達及其對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響，且是否靶向調控CD36目前還尚未可知。本研究旨在研究miR-99a-3p是否通過靶向調控CD36影響高糖誘導的小鼠足細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料 鼠腎臟足細胞系MPC5購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 將小鼠足細胞在DMEM-F12完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，平均3～4 d達80%以上融合傳代；平均10～14 d分化成熟后，饑餓培養(yǎng)24 h，用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激細胞作為高糖(HG)組，同時以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細胞作為正常對照(NG)組。將miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p分別轉染至未經任何處理的小鼠足細胞中，記為miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組。將miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36轉染至高糖處理的小鼠足細胞中，記為HG+miR-NC組、HG+miR-99a-3p組、HG+si-NC組和HG+si-CD36組。將miR-99a-3p與pcDNA、pcDNA-CD36分別共同轉染至高糖處理的小鼠足細胞中，記為HG+miR-99a-3p+pcDNA組、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-99a-3p和CD36 mRNA的表達水平 收集各組細胞，提取總RNA后反轉錄成cDNA，按試劑盒說明進行PCR擴增，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白后用BCA試劑盒進行定量，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉后加入一抗4℃孵育過夜；再加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，漂洗后用結合緩沖液重懸，然后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育；上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-99a-3p對CD36的靶向調控 構建野生型和突變型基因靶點CD36的3′UTR熒光素酶載體(WT-CD36和MUT-CD36)，將其分別與miR-NC和miR-99a-3p轉染至小鼠足細胞中，按試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1高糖誘導對小鼠足細胞中miR-99a-3p和CD36表達的影響 與NG組相比，HG組小鼠足細胞中miR-99a-3p的表達水平顯著降低；CD36 mRNA和蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表1?？梢姡咛钦T導促進小鼠足細胞中CD36的表達，抑制miR-99a-3p的表達。

表1 高糖誘導對小鼠足細胞中miR-99a-3p和CD36表達的影響

圖1 CD36蛋白表達

2.2miR-99a-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞中podocin及nephrin蛋白表達的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-99a-3p組小鼠足細胞中miR-99a-3p的表達水平顯著升高，podocin、nephrin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

1～4：NG組、HG組、HG+miR+NC組、HG+miR-99a-3p組；圖3同圖2 podocin和nephrin蛋白表達

表2 miR-99a-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞中podocin、nephrin蛋白表達及凋亡率和凋亡相關蛋白表達的影響

2.3miR-99a-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組小鼠足細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-99a-3p組小鼠足細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著降低，小鼠足細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

圖3 細胞凋亡流式圖

圖4 凋亡相關蛋白表達

2.4抑制CD36表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響 與HG+si-NC組相比，HG+si-CD36組小鼠足細胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，CD36、Bax蛋白的表達水平顯著降低，小鼠足細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。圖5，表3。

表3 抑制CD36表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響

圖5 CD36、podocin、nephrin和凋亡相關蛋白表達

2.5miR-99a-3p靶向調控CD36的表達 TargetScan預測顯示CD36與miR-99a-3p存在結合位點(圖6)。熒光素酶報告基因檢測結果(表4)顯示，轉染miR-99a-3p和WT-CD36后的小鼠足細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染miR-99a-3p和MUT-CD36后的小鼠足細胞熒光素酶活性差異不顯著。miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組CD36蛋白表達分別為：0.52±0.05、0.23±0.02、0.49±0.05、0.92±0.08。過表達miR-99a-3p，CD36蛋白的表達水平降低；抑制miR-99a-3p表達，CD36蛋白的表達水平升高(P<0.05，n=6)。見圖7。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖6 CD36的3′UTR中含有與miR-99a-3p互補的核苷酸序列

1～4:miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組圖7 miR-99a-3p靶向調控CD36的表達

2.6CD36過表達逆轉了miR-99a-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用 與HG+miR-99a-3p+pcDNA組相比，HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組小鼠足細胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，CD36、Bax蛋白的表達水平顯著升高，小鼠足細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖8、表5。

1～4：HG+miR-NC組、HG+miR-99a-3p組、HG+miR-99a-3p+pcDNA組、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組圖8 CD36、podocin、nephrin和凋亡相關蛋白表達

表5 CD36過表達逆轉了miR-99a-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用

3 討 論

足細胞損傷是糖尿病腎病DN進展的關鍵，隨著糖尿病腎病的進展，損傷積累可導致足細胞凋亡與脫落、腎小球基底膜破壞等〔8〕。因此，研究足細胞損傷機制，有助于糖尿病腎病的治療。研究發(fā)現miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥的病理發(fā)生發(fā)展中具有重要調節(jié)作用〔9〕。miR-99a過表達可以減弱腦缺血再灌注誘導的小鼠腦組織損傷和神經功能缺損〔10〕。miR-99a通過激活H9c2細胞中的Notch途徑可減少脂多糖誘導的氧化損傷〔11〕。miR-99a-3p可預測晚期結直腸癌患者的化療反應〔12〕。miR-99a對過氧化氫誘導的神經細胞氧化損傷具有保護作用〔13〕。脂多糖可明顯抑制內皮細胞中miR-99a的表達，過表達miR-99a抑制脂多糖導致的炎性因子表達升高，miR-99a對脂多糖損傷的內皮細胞具有保護作用〔14〕。本實驗結果發(fā)現在高糖誘導的小鼠足細胞中miR-99a-3p低表達，過表達miR-99a-3p表達可保護高糖刺激的小鼠足細胞損傷，且miR-99a-3p可靶向調控CD36的表達。

研究發(fā)現糖尿病大鼠巨噬細胞中CD36的表達水平升高，CD36參與糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展〔15〕。CD36參與高脂介導的足細胞凋亡，是脂代謝紊亂腎損害的重要機制之一〔16〕。CD36通過氧化應激介導脂肪酸誘導的足細胞凋亡，可能參與糖尿病腎病的過程〔17〕。CD36在糖尿病腎病中高表達，高糖能抑制人腎小管上皮細胞的增殖，促進細胞凋亡，而沉默CD36的表達可通過調控Wnt/β-catenin信號通路減弱高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡〔18〕。在近端腎小管上皮細胞中，CD36介導近端腎小管上皮細胞的凋亡而導致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展〔19〕。炎癥應激狀態(tài)下腎臟CD36表達升高，腎功能損害明顯，CD36缺失或被抑制可以改善炎癥應激導致的腎損害〔20〕。本實驗結果顯示在高糖誘導的小鼠足細胞中CD36高表達，抑制表達CD36可保護高糖刺激的小鼠足細胞損傷，且過表達CD36能逆轉miR-99a-3p過表達對高糖刺激小鼠足細胞損傷的保護作用。

綜上所述，miR-99a-3p可能通過下調CD36表達對高糖刺激的小鼠足細胞損傷有保護作用。