黃運伯 陳素玲 黃劍

(?？谑腥嗣襻t(yī)院麻醉科，海南 ?？?570208)

目前認(rèn)為術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)病理生理機制與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，因此減輕神經(jīng)炎癥、抑制細(xì)胞凋亡成為POCD研究途徑。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB是介導(dǎo)先天性免疫和炎癥反應(yīng)的通路，且參與海馬級聯(lián)炎癥反應(yīng)〔1〕。七氟烷為臨床廣泛應(yīng)用的吸入麻醉劑，被證實可引起POCD的發(fā)生〔2,3〕。故本研究建立七氟烷誘導(dǎo)的POCD老年大鼠模型，探討TLR4/NF-κB信號通路在其中的作用，以期為POCD的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只SPF級雄性SD大鼠，20月齡，體重500～600 g，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，SCXK(滬)2020-0005。

1.2藥物、主要試劑 七氟烷(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)，TLR4抑制劑TAK242(北京百奧博萊科技有限公司)，白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢艾美捷生物科技有限公司)，TLR2、NF-κB p65一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(CST中國)。SM2010R徠卡切片機(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)，Varioskan LUX酶標(biāo)儀、ABI實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技中國)、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.3動物分組及七氟烷誘導(dǎo)POCD模型建立 SD雄性大鼠30只，隨機分為對照組、模型組、TLR4抑制組，每組10只。模型建立參考文獻〔4,5〕，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于腦立體定位儀，TLR4抑制組以TAK242 10 μg側(cè)腦腦室注射，其余大鼠側(cè)腦室予以注射等量生理鹽水。側(cè)腦室注射10 min后模型組與TLR4抑制組佩戴4%七氟烷+2 L/min O2通氣面罩，經(jīng)腹部正中做3 cm切口，進行腹腔探查，探查結(jié)束后以青霉素16 U/kg腹腔注射，術(shù)后置入麻醉箱誘導(dǎo)箱中，箱底鋪適量鈉石灰，通氣流量2 L/min，4%七氟烷，七氟烷共持續(xù)吸入3 h。對照組不予以腹腔探查，置入麻醉箱中僅吸入空氣/氧氣混合體。

1.4Morris水迷宮評價大鼠認(rèn)知功能〔6〕麻醉術(shù)后24 h，進行Morris水迷宮實驗，圓形水迷宮劃分4個象限，任意選擇一個象限水面下設(shè)置隱蔽平臺，將大鼠從4個象限隨機放入水中，記錄其尋找平臺時間(逃避潛伏期)，4個象限入水點每天依次訓(xùn)練1次，每次間隔20 min，記錄第5天的逃避潛伏期。第6天進行空間探索實驗，撤去平臺，選擇任一象限放入大鼠，記錄其60 s內(nèi)穿越平臺位置次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間占比。

1.5TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況〔7〕Morris水迷宮實驗后大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸左心室-主動脈生理鹽水及4%多聚甲醛灌流固定，分離新鮮海馬組織，以4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，制成3 μm厚度切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，顯微鏡下隨機選取5個視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)，以棕黃色細(xì)胞顆粒為陽染，以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比率表示凋亡率。

1.6ELISA檢測海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平〔8〕海馬組織加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑研磨，10 000 r/min離心0.5 h(4℃)，去上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm的酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲計算IL-1β、IL-6、TNF-α濃度。

1.7實時熒光定量PCR檢測海馬組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達 海馬組織液氮中研磨，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，構(gòu)建PCR體系，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，以β-actin為管家基因，2-△△Ct法計算TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平。引物序列：TLR4：上游引物5′-AGCTGAGTTCGTGTGTTACGT-3′，下游引物5′-GCATGATGTGTGCCGTGATTG-3′；NF-κB p65：上游引物5′-TTGCAGCGTAAGTTGTTC-3′，下游引物5′-CGTAGTCGTAGCTGCGCG-3′；β-actin：上游引物5′-AGTATTCTGGCGTAGCTCGACTC-3′，下游引物5′-TAGTGTCTGAGCTTAGATCGGTA-3′。

1.8Western印跡檢測大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達〔7〕剩余海馬組織提取蛋白總量，BCA法鑒定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，添加TLR4(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)一抗稀釋液，4℃搖床孵育過夜，加入封閉液稀釋二抗(1∶5 000)，常溫孵育0.5 h，暗室中曝光、顯影及定影，Image 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值比值為蛋白相對表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留時間占比比較 與對照組比較，模型組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留時間占比減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TLR4抑制組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留時間占比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)與目標(biāo)象限停留時間占比、海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量及IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.2海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率比較 與對照組比較，模型組神經(jīng)元凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TLR4抑制組神經(jīng)元凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3海馬區(qū)IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TLR4抑制組IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4海馬組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達比較 與對照組比較，模型組TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TLR4抑制組TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較

2.5海馬組織TLR4、NF-κB p65 蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TLR4抑制組TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 TLR4、NF-κB p65 蛋白相對表達量比較

1～3:對照組、模型組、TLR4抑制組圖1 各組蛋白Western印跡

3 討 論

七氟烷是新型的鹵代羥基醚類吸入式全麻藥物，具有誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、麻醉深度易調(diào)節(jié)、對呼吸及循環(huán)抑制輕等優(yōu)勢，是全麻誘導(dǎo)的首選藥物〔9〕。研究表明，吸入麻醉引起的神經(jīng)毒性和老年認(rèn)知功能的衰退有關(guān)，但其具體機制仍有待探討〔10〕。

本研究結(jié)果提示模型建立成功；七氟烷誘導(dǎo)的POCD與海馬區(qū)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。海馬區(qū)是大腦負(fù)責(zé)記憶存儲轉(zhuǎn)換與定向等功能的重要區(qū)域，在炎癥、氧化應(yīng)激等病理條件刺激下可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶、定向能力異常等認(rèn)知功能障礙相關(guān)癥狀〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，七氟烷能促進海馬區(qū)域β淀粉樣蛋白的寡聚化，而β淀粉樣蛋白可刺激膠原細(xì)胞分泌和釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元的變性壞死。另有研究證實〔13〕，七氟烷麻醉能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激鈣超載，促進海馬神經(jīng)元凋亡，加重創(chuàng)傷性腦損傷大鼠認(rèn)知功能障礙。以上述研究均說明七氟烷誘導(dǎo)的POCD與海馬區(qū)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

TLR4是白細(xì)胞介素受體家族成員，能激活NF-κB產(chǎn)生免疫炎癥，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達〔14〕。NF-κB是TLR4/NF-κB信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其激活后能分泌促炎細(xì)胞因子，啟動獲得性免疫反應(yīng)〔15〕。Liu等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB信號通路參與糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。Jin等〔17〕通過動物實驗發(fā)現(xiàn)抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果提示七氟烷誘導(dǎo)的老年大鼠POCD與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

綜上，TLR4/NF-κB信號通路的激活參與七氟烷誘導(dǎo)老年大鼠POCD的發(fā)生，在POCD的治療研究中可考慮將TLR4/NF-κB信號通路作為切入點。