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        蔓荊子治療肝癌的潛在作用機制研究*

        2021-07-06 03:05:02卜鑫玨羅則華
        現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2021年12期
        關(guān)鍵詞:蔓荊子靶點肝細胞

        卜鑫玨,孫 梅,羅則華

        (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院/捷爾醫(yī)院,重慶 401120)

        蔓荊子(Viticis Fructus)又名蔓荊實、荊子、萬荊子、蔓青子,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,謂“蔓荊實,味苦,微寒。主筋骨間寒熱,濕痹拘攣。明目堅齒,利九竅,去白蟲。久服輕身,耐老”[1]。蔓荊子是辛涼解表常用中藥,善于清利頭面諸竅,主要產(chǎn)地為我國東南地區(qū)[2-3]。截至目前,國內(nèi)外專家對蔓荊子的活性成分及藥理作用進行了一系列系統(tǒng)研究,蔓荊子的有效成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫應(yīng)答等作用[4-7]。

        肝癌是全球第六大常見侵襲性癌癥,也是癌癥致死的第三大誘因[8]。亞洲是世界肝癌患者數(shù)最高的地區(qū)之一,其中中國占世界肝癌人數(shù)的50%以上[9]。肝癌的誘發(fā)因素很多,包括肝炎病毒感染、酒精性肝損傷、非酒精性脂肪肝疾病、肥胖、糖尿病等。關(guān)于蔓荊子及其有效成分可治療肝癌的研究較多,但其作用的分子機制尚不明確[10-11]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其潛在的作用靶點、活性成分及相關(guān)通路進行分析,為進一步研究蔓荊子治療肝癌的藥理作用提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1一般資料

        1.1.1蔓荊子活性成分與靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)輸入“Viticis Fructus”檢索蔓荊子的化學(xué)成分。按照ADME原則結(jié)合檢索結(jié)果,評價藥物化學(xué)成分在體內(nèi)的過程,將篩選條件設(shè)定為生物利用度(OB)大于30%,類藥性(DL)大于0.18,從而獲得蔓荊子的活性成分?;钚猿煞謱?yīng)的潛在作用靶點通過TCMSP的檢索功能獲得,并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)化,得到靶點名稱對應(yīng)的基因符號。

        1.1.2肝癌靶點的篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫,以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞,檢索得到與肝癌相關(guān)的作用靶基因。

        1.2方法

        1.2.1藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R軟件繪制韋恩圖,取蔓荊子活性成分靶點及肝癌靶點交集,得到蔓荊子抗肝癌的潛在作用靶點。利用Cytoscape3.6.1軟件對獲取的靶基因和活性成分進行可視化處理,從而構(gòu)建藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

        1.2.2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫,輸入蔓荊子的蛋白靶點,選擇交互作用大于0.4,限定物種為智人(Homo sapiens),去除游離節(jié)點,構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。并利用R軟件輸出可視化柱狀圖,得到核心靶點。

        1.2.3GO功能和KEGG信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對蔓荊子治療肝癌的預(yù)測靶基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。

        2 結(jié) 果

        2.1蔓荊子活性成分及其作用靶點 共篩選到蔓荊子活性成分27種,對應(yīng)靶點103個,同時篩選到與肝癌相關(guān)的靶點5 255個,取交集后共得到潛在作用靶點88個。見表1、2。

        表1 蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵靶點

        續(xù)表1 蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵靶點

        表2 蔓荊子的關(guān)鍵化合物

        2.2藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 蔓荊子治療肝癌具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特性。27種活性成分中,槲皮素、山柰酚、木樨草素3種活性成分作用靶點較多,分別作用70、28、27個靶點。88個作用靶點中,NCOA2、NCOA1、PGR 3個靶點對應(yīng)活性成分較多,分別對應(yīng)18、12、11個活性成分。

        2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 蔓荊子治療肝癌的潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含88個節(jié)點,897條邊,不同靶點對應(yīng)的“邊數(shù)”見圖1。IL6、CASP3、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1等靶點位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置,在蔓荊子抗肝癌的機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

        圖1 靶點對應(yīng)的邊數(shù)

        2.4GO功能和KEGG信號通路富集分析結(jié)果 利用DAVID平臺進行GO功能富集分析,共得到GO條目334條,其中生物過程230條,分子功能72條和細胞組分32條。按照P<0.5的閾值過濾,KEGG信號通路富集分析共得到76條通路。蔓荊子治療肝癌的靶點在生物過程方面,主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞對過氧化氫的反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、細胞對缺氧的反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)等生物過程。細胞組分方面涉及胞質(zhì)、核質(zhì)、細胞質(zhì)、細胞外空間、膜筏、線粒體等。分子功能方面涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、同源蛋白質(zhì)的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇結(jié)合、特異性DNA序列結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、類固醇激素受體活性等。由KEGG信號通路富集分析可知,蔓荊子治療肝癌的靶點主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、腫瘤壞死因子(TNF)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞型(FoxO)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、細胞周期、MAPK、HIF-1、P53、VEGF、NOD樣受體等信號通路。

        3 討 論

        本研究基于疾病-基因-靶點-藥物的研究思路,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),從分子角度系統(tǒng)闡述蔓荊子治療肝癌的潛在作用機制。本研究結(jié)果顯示,蔓荊子有效活性成分有27個,治療肝癌的作用靶點有88個,其中槲皮素(70個)、山柰酚(28個)、木樨草素(27個)活性成分作用靶點較多;NCOA2(18個)、NCOA1(12個)靶點對應(yīng)活性成分較多。這些可能是蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵作用靶點。多個研究表明,槲皮素、山柰酚、木樨草素均有抗肝癌的作用,其中對應(yīng)靶點最多的是槲皮素,其可通過調(diào)控脂質(zhì),活化線粒體,增加細胞抗氧化和胰島素敏感性,從而發(fā)揮保護肝細胞的作用;山柰酚可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CHOP自噬信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞死亡;木樨草素可顯著誘導(dǎo)細胞周期在G0/G1期停滯,通過自噬誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡[12-16]。

        GO功能富集分析顯示,蔓荊子治療肝癌生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞對過氧化氫的反應(yīng)等生物過程。RNA干擾是一種高效、特異沉默靶基因的新技術(shù)[17],張良鵬[18]研究發(fā)現(xiàn),RNA聚合酶Ⅱ重組hAFP和hTERT雙啟動子調(diào)控siRNA,可特異性抑制肝癌細胞mRNA表達及生長。過氧化氫是一種很強的氧化劑,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),從而刺激機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)會破壞多種細胞內(nèi)分子,包括DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[19]。ROS主要通過激活促炎性轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和激活蛋白-1)直接促進腫瘤,或通過誘導(dǎo)DNA損傷和癌基因激活而間接促進腫瘤的發(fā)展[20-22]。LUO等[23]研究發(fā)現(xiàn),過氧化氫對肝細胞的作用呈劑量依賴性,不同水平的過氧化氫可不同程度地抑制肝細胞的生長或增值,甚至可以顯著誘導(dǎo)G2/M期的細胞周期停滯。

        KEGG信號通路富集分析顯示,蔓荊子治療肝癌主要涉及TNF、P53、HIF-1、FoxO、NF-κB、VEGR、PI3K/Akt、MAPK等信號通路。YU等[24]研究發(fā)現(xiàn),非編碼長鏈RNA SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(SPRY4-IT1)在肝細胞癌中高度表達,其可促進肝細胞癌中的細胞增殖、細胞侵襲和遷移,誘導(dǎo)細胞周期停滯在G0/G1期并誘導(dǎo)細胞凋亡。TNF是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白,MA等[25]通過研究發(fā)現(xiàn),SPRY4-IT1是通過TNF信號通路促進肝癌的進展和轉(zhuǎn)移。WANG等[26]研究證明,銀杏葉提取物EGb761通過NF-κB/p53信號通路抑制增殖并觸發(fā)肝癌細胞凋亡。同時,LIU等[27]研究也證明,HepG2癌細胞的抑制和凋亡機制是通過啟動p53信號傳導(dǎo)途徑(包括外在和內(nèi)在凋亡途徑)的生物學(xué)功能介導(dǎo)的。缺氧是肝細胞癌和其他實體瘤的常見特征。重要證據(jù)表明,缺氧條件下存活的肝癌細胞比正常條件下生長的細胞更具抗藥性[28-29]。ZHANG等[30]研究證明,缺氧環(huán)境下HIF-1可通過增加肝癌細胞中的SNAI1轉(zhuǎn)錄來促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。肝癌干細胞經(jīng)常被激活的關(guān)鍵途徑之一是NF-κB信號傳導(dǎo)。最新證據(jù)表明,脂多糖(LPS)在加重肝細胞癌中起關(guān)鍵作用,是肝臟腫瘤微環(huán)境中的重要介體,其通過NF-κB/HIF-1α信號通路來維持肝癌干細胞的特性[31-32]。在肝臟中,F(xiàn)oxO信號通路對于細胞增殖和新陳代謝非常重要[33],YAMAGUCHI等[34]研究發(fā)現(xiàn),N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑MK-801是通過FoxO信號通路抑制HepG2、HuH-7和HLF細胞增殖。VEGF表達可間接反應(yīng)腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成情況,并提示腫瘤生長速度和轉(zhuǎn)移傾向[35]。研究顯示,丹參酮可以通過抑制VEGF/VEGFR信號通路,將肝癌細胞分裂阻滯在G0/G1期,達到抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的效果[36]。軟骨基質(zhì)低聚蛋白(COMP)會促進皮膚、肺和肝的纖維化。最新的證據(jù)表明,COMP在肝細胞癌的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[37]。LI等[38]通過研究發(fā)現(xiàn),COMP通過激活肝細胞癌細胞中的PI3K/AKT信號通路,對腫瘤細胞的生長、代謝、增殖及轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)。

        綜上所述,蔓荊子治療肝癌具有多成分、多靶點、多途徑的特點,其治療肝癌的主要活性成分是槲皮素、山柰酚,作用靶點主要涉及NCOA2、NCOA1、PGR等。同時,蔓荊子通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物過程,以及TNF、P53等信號通路來發(fā)揮治療肝癌的作用。本研究通過文獻調(diào)研論述方式對靶點的部分生物功能和通路進行了驗證,為今后的基礎(chǔ)研究和臨床試驗提供了理論基礎(chǔ)。

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