李 珂，付文君，李紅梅，于晶晶，王 浩

低度慢性炎癥是2型糠尿病(T2DM)重要的發(fā)病機(jī)制之一。腸道微生態(tài)紊亂在糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1]。25羥維生素[D(25(OH)D3]可抑制炎癥因子表達(dá)，而乳酸菌的補(bǔ)充可通過調(diào)節(jié)腸道菌群增加循環(huán)中25(OH)D3水平[2-3]。膳食纖維菊粉(Inulin,INU)作為一種益生元，通過刺激腸道益生菌的定植，減少炎癥反應(yīng)，具有改善胰島素抵抗、降低高血糖的作用[4]。本研究通過膳食纖維菊粉干預(yù)不同時(shí)期T2DM小鼠，觀察各組小鼠25(OH)D3變化與腸道菌群、炎癥因子的相關(guān)性，探討在不同時(shí)期T2DM中腸道菌群與25(OH)D3的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部購(gòu)買40只4周齡瘦素受體突變雌性小鼠(db/db)為2型糖尿病模型，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。小鼠25(OH)D3ELISA試劑盒購(gòu)自上?？ㄟ~舒生物科技有限公司。膳食纖維菊粉購(gòu)自河北省承德市豐寧平安高科實(shí)業(yè)有限公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD Bioscience公司的FACS Celesta。本研究通過了寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核(2016-044)。

1.2 T2DM小鼠模型和給藥：在寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心將小鼠禁食不禁水6 h后按2 g/kg體重口服50%葡萄糖注射液，分別于0、30、60、120 min取小鼠尾靜脈血測(cè)量血糖值。根據(jù)以往研究標(biāo)準(zhǔn)[5]，設(shè)定空腹血糖<7.0 mmol/L或葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L并<11.1 mmol/L為糖尿病前期組(PDM組，20只)，空腹血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病期組(DM組，20只)，再?gòu)腜DM組和DM組分別隨機(jī)取出10只作為菊粉干預(yù)糖尿病前期組(INU/PDM組)和菊粉干預(yù)糖尿病期組(INU/DM組)。菊粉干預(yù)組每日每只按5%(wt/wt)連續(xù)菊粉灌胃6周；模型對(duì)照組每日給予等量的生理鹽水灌胃6周。

1.3 外周血漿制備：腹腔注射1%戊巴比妥鈉注射液麻醉小鼠。采靜脈血離心，取血漿備用。

1.3.1 外周血25(OH)D3濃度測(cè)定：制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，首先分別在待測(cè)樣品孔內(nèi)先后加入樣品稀釋液和待測(cè)樣品混勻并溫育，洗滌空白孔和待測(cè)樣品孔；其次，在每孔先后加入顯色液A和B以顯色，最后在每孔加入終止液終止上述反應(yīng)。在寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室測(cè)定吸光度值，并算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.3.2 外周血炎癥因子檢測(cè)：取先前制備的外周血，在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)美國(guó)BD Bioscience公司的小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子CBA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書使用FACS Celesta BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-6、IL-10及TNF-a。使用 FCAP Array 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 血漿脂多糖LPS水平檢測(cè)：取先前制備的血漿加入鱟變形細(xì)胞樣裂解試劑孵育后，加入生色底物；最后加入冰醋酸溶液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度值并計(jì)算LPS含量。

1.4 通過16S rRNA 測(cè)序分析各組腸道菌群：菊粉干預(yù) 6 周后，從每組中隨機(jī)選擇5只小鼠至新鮮的滅菌籠。分別收集每只小鼠的新鮮糞便并提取DNA，通過 PCR 擴(kuò)增 V3、V4 區(qū)，進(jìn)一步回收純化 PCR產(chǎn)物，送公司建庫(kù)并上機(jī)測(cè)序，利用生物信息學(xué)從門、屬的水平上分析比較各組腸道菌群中發(fā)生變化的細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 菊粉干預(yù)前后各組25(OH)D3水平的比較：與未干預(yù)PDM組及DM組相比，INU/PDM組及INU/DM組中25(OH)D3均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組小鼠菊粉干預(yù)前后25(OH)D3水平的比較

2.2 相關(guān)性分析：菊粉干預(yù)不同時(shí)期T2DM 小鼠能夠降低體內(nèi)LPS及促炎因子水平，改善糖脂代謝異常；其中在屬水平與未干預(yù)PDM組及DM組相比，菊粉干預(yù)INU/PDM組及INU/DM組增加了產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的擬桿菌相對(duì)豐度(P<0.05)，同時(shí)降低了反芻螺菌_6的豐度(P<0.05)。與未干預(yù)PDM組相比，菊粉干預(yù)INU/PDM組的黏螺菌相對(duì)豐度降低(P<0.05)；與未干預(yù)DM組相比，菊粉干預(yù)INU/DM組黏螺菌相對(duì)豐度變化則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.1 25(OH)D3與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性：25(OH)D3分別與白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-a 及LPS呈負(fù)相關(guān)性，與IL-10(D)呈正相關(guān)性，見表2。

表2 25(OH)D3與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

2.2.2 25(OH)D3與腸道菌群的相關(guān)性：25(OH)D3與產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的擬桿菌相對(duì)豐度呈正相關(guān)性，與黏螺菌和反芻螺菌_6的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)性，見圖1-圖3。

圖1 25(OH)D3與擬桿菌相關(guān)分析 圖2 25(OH)D3與黏螺菌相關(guān)性分析 圖3 25(OH)D3與反芻螺菌-6相關(guān)性分析

3 討論

25(OH)D3是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式。由人體皮膚經(jīng)紫外線照射或從飲食中獲得維生素D，并在肝臟中經(jīng)羥基化作用轉(zhuǎn)化為25(OH)D3，其含量可反映維生素D的水平。近年來(lái)許多研究除了強(qiáng)調(diào)維生素D在調(diào)節(jié)鈣磷代謝、維持骨穩(wěn)態(tài)方面的潛在重要作用外，還包括維生素D受體在大量非骨骼細(xì)胞如胰腺細(xì)胞中的表達(dá)。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與其受體相結(jié)合觸發(fā)抗炎反應(yīng)，同時(shí)可通過抑制NF-κB信號(hào)通路減少IL-6及TNF-a等促炎因子的表達(dá)，從而起到保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用[6-8]。因此維生素D在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用，而這種作用可能與維生素D對(duì)胰島細(xì)胞功能、胰島素敏感性及全身炎癥的影響有關(guān)[9]。

胰島素分泌相對(duì)缺乏與胰島素抵抗是T2DM的主要發(fā)病基礎(chǔ)，而維生素 D 是維持正常胰島素分泌所必需的物質(zhì)，可改善胰島素的分泌和敏感性，對(duì)糖尿病起到一定的防治作用[10]。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示，糖尿病患者普遍存在維生素D偏低，且維生素D缺乏的人群更容易罹患糖尿病。維生素D的補(bǔ)充可增加胰島素敏感性，對(duì)T2DM預(yù)后起著積極作用[11]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡在糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著顯著的作用[12]。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過腸道黏膜屏障對(duì)多種炎癥或代謝過程產(chǎn)生影響。腸道菌群組成的改變，伴隨著腸黏膜屏障破壞、通透性增加，革蘭氏陰性致病菌產(chǎn)生的LPS(lipopolysaccharide) 轉(zhuǎn)位入血，血液循環(huán)中LPS 濃度增加，并激活 Toll 樣受體 4 信號(hào)通路而誘發(fā)一些炎癥因子如IL-6、IL-17及TNF-α的釋放，從而引起胰島素抵抗、血糖異常，導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。維生素D受體的表達(dá)能影響腸道菌群的組成及多樣性[13]。同時(shí)，腸道菌群能夠調(diào)節(jié)維生素D的代謝，包括增加25(OH)D3[14]。益生元的補(bǔ)充能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響骨的重塑，促進(jìn)骨形成，并增加維生素D受體的表達(dá)和活性[2]。益生元在不被代謝的情況下亦對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。菊粉是一種重要的膳食纖維益生元，促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，在結(jié)腸中發(fā)酵生成短鏈脂肪酸(SCFAs，如醋酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽)，已被證明可有效治療T2DM[4]。正如我們先前的研究發(fā)現(xiàn)[6]，菊粉干預(yù)不同時(shí)期T2DM 小鼠可以通過促進(jìn)短鏈脂肪酸SCFAs的擬桿菌的相對(duì)豐度來(lái)恢復(fù)腸道微生態(tài)失調(diào)。擬桿菌的相對(duì)豐度與 IL-6 和 TNF-α 呈負(fù)相關(guān)性，提示擬桿菌的增加可能增強(qiáng)菊粉的治療效果。同時(shí)，與未干預(yù)糖尿病前期組(PDM)相比，菊粉干預(yù)INU/PDM組的黏螺菌相對(duì)豐度降低(P<0.05)；與未干預(yù)DM組相比，菊粉干預(yù)INU/DM組黏螺菌相對(duì)豐度變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。菊粉干預(yù)INU/DM組中反芻螺菌_6的相對(duì)豐度顯著降低，并且上述兩種菌與 IL-6、TNF-α及 LPS 呈正相關(guān)性，進(jìn)一步證明黏螺菌和反芻螺菌_6 可以促進(jìn)炎癥形成，而菊粉干預(yù)能減輕其促炎效果。

本研究通過對(duì)膳食纖維菊粉干預(yù)不同時(shí)期T2DM小鼠的25(OH)D3水平及其與炎癥因子和腸道差異菌進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示菊粉干預(yù)INU/PDM組及DM組與未干預(yù)組相比，25(OH)D3水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，25(OH)D3與促炎因子IL-6、TNF-α及 LPS呈負(fù)相關(guān)性，與抗炎因子IL-10呈正相關(guān)性；并且25(OH)D3與產(chǎn)短鏈脂肪酸SCFAs的擬桿菌呈正相關(guān)性，與促炎黏螺菌和反芻螺菌_6呈負(fù)相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，膳食纖維菊粉的補(bǔ)充可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成改善不同時(shí)期尤其在糖尿病前期T2DM小鼠25(OH)D3水平；維生素D水平的升高能改善胰島素敏感性，減輕系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，有助于延緩T2DM的發(fā)生發(fā)展，對(duì)減少T2DM及其并發(fā)癥有一定的臨床意義。