靳宏光，朱星，李鐵，王義強，成光宇

(1.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心病中心，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學針灸推拿研究所，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，長春 130021)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病發(fā)病的重要病理基礎，嚴重危害人類健康，降低患者生活質量。長期以來AS發(fā)病機制一直備受關注，目前多數學者認為AS是一種慢性炎癥性疾病，CD40/CD40 配體(CD40/CD40L)是一對互補跨膜糖蛋白，是機體發(fā)生炎癥反應過程中重要的信號通路[1]，貫穿AS整個發(fā)病過程。參紅通絡方是長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院名老中醫(yī)經驗方，具有益氣活血、豁痰通絡作用。筆者在本實驗觀察參紅通絡方對AS大鼠粥樣硬化斑塊的影響，以揭示該藥治療AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠80只，體質量(280±20) g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(吉)2011-0004，實驗動物合格證號：SCXK(吉)2017-0005。大鼠飼養(yǎng)于吉林大學基礎醫(yī)學院動物飼養(yǎng)室，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，相對濕度50%～70%，通風良好。大鼠基礎飼料配方：面粉20%、米粉3%、玉米25%、麩皮25%、豆料20%、骨粉3%、魚粉4%。高脂飼料配方：基礎飼料77%、膽固醇3%、蛋黃粉10%，豬油10%。先將基礎飼料與膽固醇、蛋黃粉、豬油充分混合，攪拌均勻，加入適量開水制成模餅，微波爐烤干?；A飼料、膽固醇、蛋黃粉、豬油均由吉林大學動物實驗中心提供。

1.2藥物與試劑 參紅通絡方：由人參、紅景天、瓜蔞、半夏、丹參、水蛭、降香等藥物組成，本實驗采用其免煎農本顆粒(由吉林省萊沃藥業(yè)有限公司提供，藥品與批號分別為人參A1701100、紅景天A1601745、瓜蔞A1601059、清半夏A1700452、丹參A1601972、水蛭A1701020、降香A1600538)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號：J20130068 ，規(guī)格：每片20 mg)；低分子肝素鈉(商品名：吉派林，杭州九源基因工程有限公司，規(guī)格：每瓶0.3 mL，批號：160406)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，規(guī)格：每瓶80萬U，批號：20170529)。

氧化低密度脂蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(oxidation low lipoprotein enzyme linked immunosorbent assay，ox-LDL ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20181120)；可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)ELISA試劑盒(天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號：208180418)；抗腫瘤壞死因子-α(anti-tumor necrosis factor，Anti-TNF-α，兔抗大鼠，北京博奧森生物技術有限公司)；抗血管細胞黏附分子1(anti-vascular cell adhesion molecule-1，anti-VCAM-1，兔抗大鼠，博士德生物工程有限公司，批號：BST17274289)；二氨基聯(lián)苯胺3(3’-diaminobenzidine，DBA)顯色液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20181120)；0.5%聚山梨酯-20的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)，美國Santa Curz生物工程公司)；辣根酶標記羊抗鼠抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：134560)；辣根酶標記羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：136080)；增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：82418180930)；鳥類成髓細胞白血病病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆轉錄酶[寶生物工程(大連)有限公司]；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、CD40、白細胞介素-1β(IL-1β)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，批號：1914526843。

1.3實驗儀器 JJ260電子記重秤(AWH)；4K15低溫高速離心機(Heraeus)；TD-5M小型臺式離心機(山東博科科學儀器有限公司)；SpectraMax 190酶標儀(美谷分子儀器上海有限公司)；AB×51光學顯微鏡(OLYMPUS)；PM-10AO全自動顯微照相裝置(Olympus)；HHW21600電熱恒溫水浴箱(上海量壹科學儀器有限公司)；LKB～V型超薄切片機(瑞士LKB)；JEDA801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達有限公司)；CFX96TM Real-Time system熒光定量聚合酶鏈式反應分析儀(美國Bio-Rad公司)；04113R115669轉膜儀(美國 Bio-Rad)；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；KD-12-A(JY-18)高壓滅菌器(浙江凱德醫(yī)療器械有限公司)；SW-CJ-2FD無菌超凈操作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；電泳儀(Eps600)；722s紫外可見分光計(上海精密科學儀器有限公司)；Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(上海Tanon科技有限公司)；T10型勻漿機(德國IKA)；U570-86 -80 ℃超低溫冰箱(英國New Brunswick Scientific)。

1.4動物的分組與造模 將大鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數字表法分為5組，每組16只：假手術組、模型對照組、中藥小劑量組、中藥大劑量組、辛伐他汀組。

參考文獻[2]方法，假手術組結扎頸外動脈，不行球囊損傷術，其余各組用球囊損傷主動脈。所有大鼠麻醉后仰臥固定，頸部備皮，取頸部正中偏左3 mm 切開皮膚，切口長 2.5～3.5 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉。左側頸總動脈下穿2根4號絲線，結扎遠端，另一根線放置近端備用。在靠近血管遠端結扎處，剪一“V”型小口。假手術組直接在小口近心端結扎，其余各組大鼠用準備好的球囊沿小口處插入頸外動脈，繼續(xù)順著血管往下插，經過頸總動脈到達主動脈，調節(jié)壓力泵以200～600 kPa擴張球囊，放松絲線，恢復血液供應，來回緩慢抽動球囊3次后撤出球囊，靠近頸總動脈分叉處結扎頸外動脈近端，抽去頸總動脈處絲線，恢復動脈血流，查看頸總動脈及頸內動脈是否充盈搏動良好。各組大鼠均用聚維酮碘溶液清洗組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，逐層縫合。術后預防性給予青霉素 20萬U皮下注射，連用3 d；低分子肝素鈉注射液521 U·kg-1皮下注射，連用3 d。術后普通飼料飲食，自由飲水1周。

術后第2周，除假手術組仍給予普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)。根據前期預實驗結果，球囊損傷+高脂飲食喂養(yǎng)6周后，大鼠膽固醇及三酰甘油水平明顯升高，頸總動脈蘇木精-伊紅(HE)染色出現(xiàn)粥樣硬化斑塊，提示造模成功。

1.5給藥方法 造模成功后，中藥小劑量組、中藥大劑量組分別給予參紅通絡方免煎農本顆粒7.15和28.60 g·kg-1·d-1，溶于溫水2 mL灌胃；辛伐他汀組給予辛伐他汀1 mg·kg-1·d-1，溶于溫水2 mL灌胃；假手術組、模型對照組給予等容積0.9%氯化鈉溶液灌胃。均每天1次，連續(xù)8周，以上劑量均按《醫(yī)學實驗動物學》人、鼠劑量轉換公式換算。

1.6觀察指標與測定方法 血清樣品的制備：實驗結束后摘眼球取血，室溫放置30 min～2 h，血清析出后3000 r·min-1(r=15 cm)離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

動脈標本的取材：將取完血清的大鼠處死，取損傷部位動脈，截取1～2 cm置于4%多聚甲醛備用，剩余部分置微型離心(eppendorf，EP)管，-80 ℃冰箱保存待測。

大鼠血清ox-LDL、sCD40L的測定：從冰箱取出 ELISA試劑盒及血樣，室溫復溫約30 min，按試劑盒說明書進行操作。

頸總動脈病理形態(tài)觀察：將頸總動脈置4%多聚甲醛固定液48～72 h，0.1 mol·L-1中性磷酸鹽緩沖液(PBS)液充分洗滌，過夜，修復組織塊，梯度乙醇，二甲苯、浸蠟Ⅰ1、Ⅱ處理，石蠟包埋，LKB～V型超薄切片機切片，厚3～4 μm，每塊組織切5片，以防損壞備用。病理攤烤片機干燥，切片后HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

免疫組化法觀察斑塊細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、TNF-α表達：①操作步驟，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，SP)法檢測)，a.頸總動脈組織修塊固定，脫水透明，石蠟包埋切片；b.PBS(0.01 mol·L-1，pH值7.5±0.1)沖洗；c.對組織抗原進行相應修復；d.每張切片加過氧化氫酶阻斷溶液(H2O2)，室溫孵育10 min，PBS沖洗；e.除去PBS液，每張切片加正常非免疫動物血清，室溫孵育；f.除去血清，每張切片加第一抗體；g.PBS沖洗，每張切片加生物素標記的第二抗體，室溫孵育，PBS沖洗；h.除去PBS液，每張切片加第三抗體鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育，PBS沖洗；i.除去PBS液，每張切片加氧化二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液，顯微鏡下觀察；j.純化水沖洗，蘇木精復染，水洗，氨水返藍。切片經過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。②結果的判定：以光鏡下內皮細胞胞質染成淺黃色、棕黃色或棕褐色為陽性著色。按陽性染色細胞所占比例分為3級：陽性染色細胞占15%～35%為弱陽性反應(+)；陽性染色細胞占36%～75%為陽性反應(++)；陽性染色細胞占75%以上為強陽性反應(+++)；將免疫組化切片置顯微鏡下，免疫組化反應顯色強度JEDA801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)進行分析并測定頸總動脈內皮ICAM-1、TNF-α灰度值(即反映組織化學染色產物深淺程度：灰度值越大，則反映產物濃度越小，反之，濃度越大)，每張切片取視野5個，取平均值。

AS斑塊內CD40mRNA及IL-1B mRNA表達：①RNA的提取，取凍存大鼠頸總動脈50 mg，置研缽中迅速在液氮中研成粉末，采用Total RNA提取試劑常規(guī)提取總RNA，DNase I(RNase Free)進行DNA消化。②反轉錄反應：采用反轉錄反應體系20 μL合成cDNA。③Real-Time PCR反應：取反轉錄后產物cDNA作為模板進行PCR擴增。擴增以GAPDH基因表達作為內參照，GAPDH上游引物序列：5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，下游引物序列：5′-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG -3′；CD40上游引物序列：5′-ATACCCTCTGTGGTTTCCAGC-3′，下游引物序列：5′-TCCTTTGGTTTGACCACC-3′；IL-1β引物序列：上游5′-CGATGGTCCCAATTACATGA-3′，下游：5′-TTGTAGGGTTGGCAGGAGAT-3′，Real-time PCR反應體系20 μL，含SYBRP remixExTaqTM (×2)10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L-1)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，ROX Reference Dye (×50)0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。多次循環(huán)，變性、退火、延伸，每個樣本重復3次。Real-time PCR儀數據分析軟件(SDDS，Version 1.3，Taq Man)得出CD40、IL-1β和GAPDH的CT值。

2 結果

2.1一般情況 隨著喂養(yǎng)時間延長，各組大鼠體質量均增加，假手術組大鼠反應靈敏，進食飲水正常，毛色潤澤，體質量增長，精神狀態(tài)良好；模型對照組反應較遲鈍，喜蜷縮，毛色暗沉，體質量增長較少。其他組大鼠反應、進食、毛色、精神方面均優(yōu)于模型對照組。

2.2大鼠死亡情況 球囊損傷術前假手術組死亡1只，考慮死亡原因可能為麻醉藥不耐受。球囊損傷術后假手術組、辛伐他汀組、中藥大劑量組各死亡3只，模型對照組、中藥小劑量組各死亡2只，考慮死因可能為手術牽拉迷走神經導致腸梗阻。高脂飲食飼喂過程中，模型對照組、中藥小劑量組大鼠各死亡1只。最終假手術組存活12只，其他4組各存活13只。

2.3ox-LDL與sCD40L測定結果 見表1。與假手術組比較，模型對照組大鼠血清ox-LDL、sCD40L含量均顯著升高 (P<0.01)；與模型對照組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L含量均不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，中藥大劑量組與辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L降低程度差異無統(tǒng)計學意義。

表1 5組大鼠ox-LDL與sCD40L測定結果Tab.1 Determination of ox-LDL and sCD40L in five groups of rats

2.4頸總動脈病理形態(tài) 結果見圖1。假手術組頸總動脈結構完整，內膜連續(xù)，平滑肌細胞及彈力纖維板排列整齊；模型對照組頸總動脈結構破壞明顯，可見大量泡沫細胞、巨噬細胞及淋巴細胞浸潤，中膜層明顯萎縮，平滑肌細胞排列明顯紊亂，彈力纖維板呈波浪狀排列，板間間隙增大，部分呈斷裂狀態(tài)；中藥小劑量組頸總動脈內膜較不光滑，內皮下可見中等量泡沫細胞、巨噬細胞及淋巴細胞聚集，平滑肌細胞排列較紊亂，彈力板間隙變大，但該組病理變化較模型對照組明顯減輕；辛伐他汀組、中藥大劑量組頸總動脈病變顯著減輕，內膜較光滑，彈力纖維板間隙增大不明顯，平滑肌細胞排列較整齊，未見明顯泡沫細胞、巨噬細胞及淋巴細胞。

圖1 5組大鼠頸總動脈HE染色(×200)Fig.1 HE staining on common carotid arteries in five groups of rats(× 200)

2.5斑塊中ICAM-1表達情況 結果見圖2。假手術組頸總動脈內皮結構清晰，幾乎無染成黃色的ICAM-1存在；模型對照組大鼠頸總動脈內皮局部可見大量ICAM-1表達，其他各組大鼠頸總動脈內膜可見ICAM-1表達，但顯著少于模型對照組。

圖2 5組斑塊中ICAM-1表達情況 (×200)Fig.2 ICAM-1 expression in the plaques of five groups of rats(× 200)

2.6斑塊中TNF-α表達情況 見圖3。假手術組大鼠頸總動脈未見TNF-α表達，模型對照組大鼠頸總動脈TNF-α表達明顯，其他各組大鼠頸總動脈棕黃色顆粒較模型對照組顯著減少，提示TNF-α表達明顯降低。

圖3 5組斑塊中TNF-α表達情況(×200)Fig.3 TNF- α expression in the plaques of five groups of rats(× 200)

2.7斑塊中CD40mRNA表達情況 見圖4。與假手術組比較，模型對照組斑塊內CD40mRNA表達量顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，辛伐他汀組、中藥大劑量組、中藥小劑量組斑塊中CD40mRNA表達量顯著降低(P<0.01)，其中中藥大劑量組略小于辛伐他汀組與中藥小劑量組。

2.8AS斑塊內IL-1βmRNA表達情況 見圖5。與假手術組比較，模型對照組斑塊內IL-1βmRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，辛伐他汀組、中藥小劑量組斑塊內IL-1βmRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥大劑量組斑塊內IL-1βmRNA降低更顯著(P<0.01)。

①與假手術組比較，t=13.387，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.617～5.120，P<0.01。圖4 5組斑塊中CD40 mRNA相對表達①Compared with sham operation group，t=13.387，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.617-5.120，P<0.01.Fig.4 The mRNA expression of CD40 in the plaques of five groups of

①與假手術組比較，t=6.072，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.091～3.158，P<0.05；③與模型對照組比較，t=4.138，P<0.01。圖5 5組斑塊內IL-1β mRNA表達情況①Compared with the sham operation group，t=6.072，P<0.01；②Compared with the model control group，t=2.091-3.158，P<0.05；③Compared with the model control group，t=4.138，P<0.01.Fig.5 The mRNA expression of IL-1β in the plaques of five groups of

3 討論

CD40/CD40L通路是重要的免疫炎癥反應通路，在非疾病狀態(tài)下，CD40、CD40L處于不表達或低表達狀態(tài)，遇到炎癥等刺激會導致其表達量顯著上調。CD40L與CD40配接成功后激活CD40，促使其進入細胞內與TNF受體相關因子(TNF receptor-associated factors，TRAFs)銜接[3-4]，CD40與TRAFs銜接完成后，促使下游黏附分子(如ICAM-1)、炎癥因子(如IL-1β和TNF-α等)等大量釋放，為AS發(fā)生發(fā)展提供強大動力。多項研究結果表明，抑制CD40/CD40L信號通路及其相關信號分子能有效延緩AS進程[5-8]。

LOX-1是ox-LDL結合的重要位點，與ox-LDL結合后可以激活CD40/CD40L通路，極大促進活性氧物質及炎癥因子釋放，嚴重損害血管內皮功能，對泡沫細胞的形成及內膜增生具有推動作用[9]，并能破壞線粒體DNA，參與血管細胞凋亡和自噬[10]。臨床研究顯示，黏附分子與冠心病和急性心肌梗死有關，可以作為疾病診斷、治療及評估預后的參考指標[11]。動物實驗已經證實，黏附分子缺乏避免了免疫成分細胞的黏附及遷移，也顯著減輕了LDL-/-鼠AS損傷[12]。TNF-α是由巨噬細胞分泌的對腫瘤細胞有極強殺傷力的小分子生物活性蛋白。動物研究顯示，ApoE-/-小鼠注射TNF-α后內皮細胞LDL轉胞吞作用增強，LDL顆粒在血管壁沉積增多[13]，刺激了AS產生。同時TNF-α通過刺激白細胞介素及趨化因子等的釋放，激活嗜中性粒細胞，促使炎癥細胞在損傷部位的聚集，并參與血栓形成、血管重塑、內皮細胞凋亡及誘導氧化應激等多個環(huán)節(jié)，加劇AS病變[14-15]。抑制TNF-α可能對亞臨床AS具有預防作用，并可能延緩AS進展[16]。IL-1β通常以無活性前體形式存在，遭遇炎癥刺激后經Caspase-1酶剪切活化[17]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β對于泡沫細胞的形成具有明顯推動作用[18]，能夠促進內皮細胞分泌多種黏附分子，增強免疫炎癥反應，同時對巨噬細胞、粒細胞活性及APC抗原遞呈能力具有顯著提升作用，還能刺激蛋白分解酶產生[19]，可以說IL-1β是一種強有力的免疫炎癥刺激因子，影響AS發(fā)展。應用IL-1β單克隆抗體能明顯減少ApoE-/-小鼠斑塊數量。不僅如此，一項隨機、雙盲、安慰藥對照的大型臨床試驗亦顯示，IL-1β抑制藥康納單抗能顯著降低心肌梗死患者炎癥反應，使AS患者心血管終點事件下降15%[20]，表明降低IL-1β含量可能成為防治AS的有效方法。上述研究表明，CD40/CD40L通路與AS密切相關，LOX-1、CD40、CD40L作為通路上游信號，ICAM-1、sCD40L、TNF-α、IL-1β作為通路下游信號，在CD40/CD40L通路整個信號轉導過程中發(fā)揮重要作用，這些信號分子表達上調時刺激AS發(fā)生，抑制這些信號分子的表達則有利于延緩AS進展。

本研究結果顯示，與模型對照組比較，中藥大劑量組與小劑量組ox-LDL、sCD40L含量均不同程度下降，中藥大劑量組與辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L降低幅度相當；頸總動脈HE染色顯示，中藥大劑量組病變程度顯著減輕，內膜較光滑，彈力纖維板間隙增大不明顯，平滑肌細胞排列較整齊，未見明顯泡沫細胞、巨噬細胞及淋巴細胞；中藥大劑量組與小劑量組斑塊中ICAM-1、TNF-α表達顯著減少；通過熒光定量PCR法檢測AS斑塊內CD40mRNA及IL-1βmRNA表達顯示，中藥大劑量組大鼠斑塊內CD40mRNA與IL-1βmRNA表達顯著降低，CD40mRNA降低與辛伐他汀組相當，IL-1βmRNA降低優(yōu)于辛伐他汀組。綜上所述，參紅通絡方具有較好抑制炎癥因子、抗AS、穩(wěn)定易損斑塊作用，該作用可能通過干預CD40/CD40L信號轉導實現(xiàn)。