段慧娟，方小英，朱林慧，李貝娜，彭思穎，楊振德

（廣西大學林學院 南寧市 530004）

木質素是具有復雜結構的高分子化合物，是由苯丙烷單元結構通過醚鍵和碳碳鍵組成的具有三維空間結構的無定型芳香類化合物，與纖維素和半纖維素構成植物骨架的主要成分[1]。其不易降解，但含量豐富，占陸生植物干重15%～40%，是含量僅次于纖維素的生物多聚體[2-3]。木質素作為農作物秸稈以及城市生活垃圾中常見的難降解物質[4]，將其焚燒既產生資源浪費，又造成環(huán)境破壞。同時，木質素作為造紙業(yè)的副產物，由于難降解，如果直接排放環(huán)境中，會造成水生生態(tài)系統(tǒng)的破壞[5]。由于存在于細胞壁中的纖維素受到木質素的保護，木質素是否被有效降解對纖維素降解有著重要作用[3]。因此，開發(fā)高效降解木質素的技術成為木質纖維素資源化利用與環(huán)境保護的重要問題。

目前木質素降解方法主要為物理法、化學法和生物法。微生物降解法具有反應條件溫和、成本低、環(huán)境友好等特點[6]，成為國內外研究者關注的焦點。其原理為降解木質素的微生物通過氧化斷裂木質素側鏈Cα-Cβ鏈，徹底降解產物主要是CO2和H2O[7]。目前研究木質素降解菌株中主要以真菌、細菌為主，真菌中白腐菌對木質素具有強的降解能力，受到廣泛關注[6]。然而細菌具有適應性強、來源廣，更易于工業(yè)化生產等優(yōu)點，具有廣闊的發(fā)展前景。細菌通過產酶對木質素進行降解，主要包括3種酶：漆酶、木質素過氧化物酶與錳過氧化物酶。每個漆酶蛋白分子含有4個銅原子，是漆酶催化反應的活性中心[8]。范晶晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)金屬銅離子和錳離子在合適的濃度能刺激產漆酶，酶活性最高可達263.44 U/L。木質素過氧化物酶主要來源于真菌，在細菌中如鏈霉菌（Streptomycescinnamomensis）能夠分泌過氧化物酶降解木質素，但活性較低。Jing等[10]通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成使過氧化物酶活性得到大幅度提升。

昆蟲對地球上所有可利用的物質資源幾乎都可以分解，如天牛幼蟲蛀食木材，其腸道微生物處于常溫中性條件下可對木材消化降解[11]。本研究以云斑白條天?！睟atocera lineaolata（Chaevroat）〕為研究對象，利用愈創(chuàng)木酚選擇性培養(yǎng)基和苯胺藍平板法，初步篩選其腸道內具有木質素降解功能的菌株，以期為木質素降解菌株資源的開發(fā)與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和培養(yǎng)基

樣品為云斑白條天牛4齡幼蟲，于2018年5月上旬至6月上旬采集于廣西國有高峰林場六里分場（108°20′E，22°58′N）的桉樹林。

愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基[12]：愈創(chuàng)木酚1.0 g，酒石酸銨0.1 g，蛋白胨2.6 g，MnSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，Na2HPO40.2g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000mL，調節(jié)pH至7.0～7.2，121℃高壓滅菌20 min。

苯胺藍培養(yǎng)基[12]：苯胺藍0.1 g溶于10 mL蒸餾水，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至990 mL，分開121℃高壓滅菌20 min。

1.2 木質素降解菌的初篩

選取3頭云斑白條天牛4齡幼蟲，用酒精沖洗并浸泡3 min進行表面消毒。用無菌水沖洗3次。在垂直超凈工作臺上，用解剖針、解剖剪、鑷子解剖取出腸道，將腸道上的脂肪等物質用無菌水沖走后放入玻璃勻漿器，加入1 mL無菌水進行研磨，制成腸道勻漿液。用高速冷凍離心機以5 000 r/min離心5 min。

取稀釋103、104、105倍的勻漿稀釋液各100μL均勻涂布在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上，每個濃度3個重復，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d。，待菌落長出后，用接種環(huán)從每種稀釋梯度的培養(yǎng)基上挑取大小、形態(tài)、顏色有差異的單菌落，在新的愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上劃線分離4～5次，直至得到單一純菌落。選擇培養(yǎng)基以愈創(chuàng)木酚為唯一碳源，因此，可在該選擇培養(yǎng)基上生長的菌落即可初步確定為具有降解木質素能力的細菌。

1.3 木質素降解菌的復篩

將獲得的各個純培養(yǎng)菌株用接種環(huán)點種在苯胺藍培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱30℃倒置培養(yǎng)2 d后，出現(xiàn)透明水解圈，用游標卡尺測量水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），進行3次重復取平均值，計算水解圈和菌落直徑比值（D/d），選擇D/d值大的菌株即為降解木質素能力強的菌株。

1.4 木質素降解菌的鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)觀察根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對分離所得的菌株進行菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色反應測定。

1.4.2 菌株16SrDNA基因測序

將在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d的菌株接種到液體愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48 h后，取細菌懸液2 mL，11 500 r離心1 min，倒去上清液。采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302），按其說明書提取供試菌株的總DNA，用Nanodrop 2 000可見分光光度計測定所提取DNA的OD260/OD280比值，確定DNA純度和濃度，在DYY-8C電泳儀上用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA是否有降解現(xiàn)象。采用王蕊蕊等[15]的方法，以提取的總DNA為模板，利用細菌16SrDNA的通用引物：正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 反向 引物1 492 R（5’-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3’）進行PCR擴增，PCR反應體系為：12.5μL Eay Taq PCR SuperMix（+dye），1.0μL 27F（10 mmol/L）和1.0μL 1 492 R（10 mmol/L），1.0μL DNA模 板（50 ng/μL）12.5μL ddH2O。反應條件為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72℃10 min終末延伸；4℃條件下保存。反應完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后委托北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。在NCBI平臺（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上將測序的結果進行Nucleotide BLAST序列比對，并用MEGA 7.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌屬分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)

在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上共篩選出37株細菌菌株，其中，B01和B12菌株在苯胺藍平板上水解圈直徑（D）分別為0.95 cm和0.80 cm，菌株菌落直徑分別為0.60 cm和0.50 cm，D/d值分別為1.60和1.58，比值最大（圖1）。其中菌株B01在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上為白色，表面光滑，邊緣規(guī)則，單菌落呈現(xiàn)圓形，中間顏色較邊緣深，不透明。革蘭氏染色呈現(xiàn)紅色，桿狀，可以判定菌株B01為革蘭氏陰性菌。菌株B12在培養(yǎng)基上為白色，表面光滑，邊緣規(guī)則，單菌落呈現(xiàn)圓形，中間凸起，不透明，革蘭氏染色呈現(xiàn)紅色，球狀，判定為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株B01和B12在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上的菌落特征及在苯胺藍培養(yǎng)基上的水解圈

2.2 菌株的16S rDNA序列分析

提取菌株B01和菌株B12的DNA之后，通過細菌通用引物27F-1 492 R進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，所得基因片段如圖2所示，條帶明亮清晰，均在1 500 bp左右。

圖2 菌株B01和B12的PCR擴增產物

據(jù)測序結果在NCBI上進行分析比對，選取BLAST中相似度較高的細菌序列，并下載相關序列后，利用MEGA7.0軟件的NeighborJoining法構建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，菌株B01和Pseudo?monasbaetica（NR 116 899.1）在同一分支上，因此，將該菌初步判斷為假單胞菌屬；菌株B02和Kosako?nia arachidis（NR 116 403.1）在同一分支上，因此，將該菌初步判斷為考氏科薩克氏菌屬。

圖3 菌株B01和B12的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

細菌具有良好的環(huán)境適應性與豐富的生物多樣性，在強酸、強堿、高溫等環(huán)境下可以生存，在降解木質素上具有很好的發(fā)展?jié)摿16]。近些年來，細菌降解木質素的研究受到越來越多的關注。降解木質素的細菌主要有厭氧梭菌屬（Clostridium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、雙芽孢桿菌屬（Amphiba?cillus）、微球菌屬（Micrococcus）等[17]。木質素降解酶系非常復雜，其完整的代謝途徑與降解機理尚未明確[16]，代謝途徑研究較為明確的主要是以鞘氨醇單胞菌SYK-6為研究對象構建的代謝途徑[17]。細菌降解木質素獲得大量有用代謝產物，如生物乙醇、生物柴油、沼氣、氫氣等新能源物質[18]。因此，研究新的木質素降解菌資源，對環(huán)境保護、資源利用等具有重要意義。

本研究從云斑天牛腸道內分離獲得具有降解木質素能力的細菌菌株2個，分別屬于假單胞菌屬和考氏科薩克氏菌屬。假單胞菌屬屬于變形菌門（Proteobacteria）假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的細菌，考氏科薩克氏菌屬屬于變形菌門（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的細菌。假單胞菌屬是木質素最有效降解者[19]，為油污土壤微生物中的優(yōu)勢菌屬[20]，作為非絲狀細菌可降解木質纖維素低分子量部分以及木質纖維素的降級產物[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬生長溫度范圍較廣，在4℃～43℃均可生長，其多數(shù)最適生長溫度為30℃，在pH值為7.0～8.5之間生長，生長范圍較小[22]。假單胞菌屬與其他細菌組成復合菌群可進一步提高木質素降解速率[23]，Ca2+、Mn2+和Fe3+對熒光假單胞菌GcM5--1A胞外木質素過氧化物酶活力有較強的促進作用[24]。

目前關于考氏科薩克氏菌屬木質素降解研究較少，未建華[25]從黃翅大白蟻（Macrotermesbarneyi）腸道固氮微生物中分離得到Kosakonia屬，其大多為固氮菌[26]。李鋒[27]以堿木質素為唯一碳源，從白蟻（Termite）腸道中分離出Kosakonia屬。木質素降解酶的合成與活性的強弱受培養(yǎng)基環(huán)境的pH影響較大[28]。傅慧靜等[28]發(fā)現(xiàn)松墨天牛（Monochamusalter?natus）腸道中的黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）處于偏酸性環(huán)境中過氧化物酶活性較強，陳建軍等[29]研究發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌（Phanerochaetechrys?osporium）的漆酶在pH=4時活性較大，可見酸性條件對酶的活性也有較大影響。

本研究從云斑天牛腸道細菌中分離出考氏科薩克氏菌屬，豐富了木質素降解菌株資源，為云斑天牛腸道微生物進一步開發(fā)利用提供了理論基礎。下一步將對假單胞菌屬和考氏科薩克氏菌屬降解木質素的微觀過程、降解機理以及菌株的產木質素降解酶的工業(yè)化生產條件等方面開展深入研究。