祖慶學(xué)，李宏江，聶忠揚(yáng)，于曉飛，張翼飛，李昊熙*

（1.貴州省貴陽市煙草公司開陽縣分公司 貴陽市 550300；2.貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽市 550025）

烤煙是貴州省的一種重要經(jīng)濟(jì)作物，但是烤煙生產(chǎn)受到多種病蟲害的威脅。煙草花葉病毒（To?bacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucum?ber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato vi?rus Y，PVY）3種正義單鏈核糖核酸（+ssRNA）病毒長期困擾了貴州各個主要煙區(qū)[1-4]。病毒病不僅降低了烤煙產(chǎn)量，還影響了產(chǎn)品的質(zhì)量和分級，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。由于植物病毒的治療手段非常有限，抗病毒品種的選育和早期染病植株的清除是控制病毒病的主要手段[6]。3種病毒中，CMV和PVY主要經(jīng)過蚜蟲等介體昆蟲進(jìn)行非持續(xù)性傳播，而TMV則主要依靠機(jī)械摩擦傳播，因此，針對性開展的阻斷傳播的防控手段就不盡相同。所以，病毒種類的快速和高效地檢測是非常重要的工作。3種RNA病毒寄主范圍很廣，主要包括辣椒、馬鈴薯等蔬菜作物，還有許多種雜草。在烤煙植株上，TMV和CMV都表現(xiàn)出了相似的“花葉”病狀，主要表現(xiàn)在幼株葉片不規(guī)則褪綠、葉片卷曲，以及成株矮小甚至整片葉面黃化等現(xiàn)象。而PVY的田間癥狀與前面2種差異較大，比如沿著葉脈的褪綠[7]。而病毒病癥狀易受煙株的發(fā)育程度、氣候條件和病毒株系的影響，增加了田間判斷發(fā)病與否以及區(qū)分癥狀種類的難度。近年來，多種病毒的復(fù)合侵染烤煙的報道逐漸增多[8-9]，進(jìn)一步加大了病毒檢測工作的難度。

目前植物病毒檢測主要采取血清學(xué)和分子生物學(xué)方法[6]。血清學(xué)方法常借助于預(yù)先準(zhǔn)備特異性抗體相關(guān)的材料[9-11]，而分子生物學(xué)檢測所需的PCR儀等常規(guī)裝置，因其實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)備以及操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，更容易成為生產(chǎn)實(shí)踐推廣的快速檢測技術(shù)。本研究利用基層檢測站點(diǎn)的PCR儀等設(shè)備，通過靶定外殼蛋白基因特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物和PCR條件，開發(fā)一套針對貴州煙區(qū)3種RNA病毒（TMV、CMV和PVY）的檢測方法。

1 材料方法

1.1 烤煙樣品的采集

2020年7月采集烤煙旺長期的感染病毒葉片，葉片樣品包括4種癥狀類型，使用Agdia牌試紙條檢測了感染病毒的種類，詳細(xì)標(biāo)本的名稱、癥狀、采集地與煙草品種的信息如表1所示。

表1 染病煙葉樣品的相關(guān)信息

1.2 樣品總RNA的提取及其c DNA的合成

每個樣品稱取100 m g的葉片組織，加入液氮后充分碾磨，將碾碎的粉末加入離心管中用于總RNA的提取。提取步驟參照RNeasy?Plant Mini Kit（Qiagen）試劑盒：首先在碾磨充分的樣品加入450μL的RLT緩沖液，振蕩均勻；然后將混合液體轉(zhuǎn)入配套的QIAshredder層析管中，14 000 r/min離心2 min，在上清液中加入1/2體積的無水乙醇；又將混合液體轉(zhuǎn)入配套的RNeasy層析管中，14 000 r/min離心15 s后，用RW1緩沖液洗脫1次，RPE緩沖液洗脫2次；最后用30μL去RNA酶溶解總RNA產(chǎn)物。RNA提取前用0.1%的DEPC水處理所有工具與操作臺，杜絕RNA酶干擾。

使用2μL的總RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（ThermoScientific）的25μL反應(yīng)體系，包括了：1μL的Oligo（dT）18引物混合物，4μL的5×Reaction Buffer，1μL的RiboLockRNase Inhibitor（20 U/μL），2μL的dNTP混合液（10 mM），1μL的RevertAid MMuLV RT（200 U/μL）。得到的cDNA保存用于后續(xù)檢測反應(yīng)。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)

從GenBank中下載得到TMV（No.NC_001 367）和PVY（No.NC_001 616）的全基因組序列，CMV基因組中包含了外殼蛋白（Coat Protein，CP）基因的第III片段（No.NC_001 440）的序列，以及各個基因組中外殼蛋白編碼基因的具體范圍信息。分別針對3種病毒的外殼蛋白基因特異性區(qū)域設(shè)計(jì)了3對引物，如表2所示。主要的設(shè)置條件是3對引物覆蓋的基因片段的長度具有較大的差異，分別為：TMV-120 bp，CMV-240 bp和PVY-660 bp，退火溫度均為55?C。

表2 3種病毒的引物序列

PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。

1.4 單一引物檢測

將3對引物分別與3種病毒的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測所設(shè)計(jì)引物的特異性。具體操作如下：利用3個單一病毒侵染葉片樣品（T、C和P）得到的cDNA作為模板，分別與設(shè)計(jì)的3對特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的上、下游引物，13μL的2X SanTaq PCR Master Mix（with Blue Dye，生工 生物）。反應(yīng)條件同1.3。PCR反應(yīng)的結(jié)果用凝膠電泳檢測。

1.5 3對引物的混合體系檢測

構(gòu)建3對引物的混合體系，反應(yīng)體系為25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的全部3對上、下游引物的混合物，13μL的Qiagen Multiplex PCR Master Mix，然后對樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測感染病毒的種類。首先將3個單一病毒侵染樣品（T、C和P）的cDNA分別作為模板，無DNA模板的反應(yīng)（N）作為空白對照進(jìn)行反應(yīng)。其次利用同時被2種病毒感染的葉片（D）得到的cDNA作為模板，無DNA模板的體系（N）作為空白對照，分別重復(fù)2次進(jìn)行反應(yīng)。然后利用3個單一感染樣品的cDNA的混合物（M）作為模板，無DNA模板的體系（N）作為空白對照，也分別重復(fù)2次進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件全部同1.3。PCR反應(yīng)的結(jié)果用凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 樣品的免疫試劑條檢測

采集到的感染病毒的烤煙葉片樣品的免疫試紙條檢測結(jié)果如表1所示，樣品T、C和P分別僅僅感染了煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），樣品D同時感染了CMV和PVY。

2.2 引物特異性的PCR檢測

在相同的PCR反應(yīng)程序下，3對引物分別能夠特異性地從3種病毒的cDNA中擴(kuò)增出外殼蛋白片段條帶。如圖1所示，TMV引物（TMV_CP_F1與TMV_CP_R1）僅僅只能從含TMV的樣品T的cDNA模板中擴(kuò)增出對應(yīng)的120 bp的片段，而CMV（CMV_CP_F1與CMV_CP_R1）和PVY（PVY_CP_F1與PVY_CP_R1）的引物僅能從對應(yīng)的引物中擴(kuò)增出240 bp和660 bp的特異性片段。

圖1 3對引物（A-TMV引物，B-CMV引物，C-PVY引物）分別針對3種病毒（T-TMV，C-CMV，P-PVY）的c DNA的PCR電泳圖

2.3 單一感染的檢測結(jié)果

在相同的反應(yīng)程序下，通過1次相同的PCR反應(yīng)，3對引物的混合體系就分別特異性地從3種病毒的cDNA中擴(kuò)增出對應(yīng)大小的外殼蛋白片段條帶。如圖2所示，引物混合體系僅能從樣品T、P和C的cDNA模板中擴(kuò)增出120 bp（TMV）、660 bp（PVY）和240 bp（CMV）片段，空白對照無反應(yīng)。

圖2 3對引物混合檢測單一感染樣品（T-TMV，P-PVY，C-CMV，N-空白對照）的病毒種類PCR反應(yīng)電泳圖

2.4 雙重感染的檢測結(jié)果

通過3對引物混合體系的PCR反應(yīng)，也能夠根據(jù)擴(kuò)增出條帶的大小檢測雙重侵染樣品中2種病毒的種類。如圖3所示，引物混合體系從樣品D的2個重復(fù)反應(yīng)（D1和D2）中擴(kuò)增出2條條帶，大小分別是240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白對照（N1和N2）無反應(yīng)。

圖3 3對引物混合檢測雙重感染樣品（D-CMV和PVY，N-空白對照）的病毒種類PCR反應(yīng)電泳圖

2.5 3種病毒c DNA混合物的檢測結(jié)果

通過3對引物混合體系的PCR反應(yīng)，還能夠根據(jù)擴(kuò)增出條帶的大小檢測3種病毒DNA混合物的種類。如圖4所示，引物混合體系從TMV、CMV和PVY 3種病毒cDNA混合物M的2個重復(fù)反應(yīng)（M1和M2）中擴(kuò)增出3條條帶，大小分別是120 bp（TMV）、240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白對照（N1和N2）無反應(yīng)。

圖4 3對引物混合檢測3種病毒混合DNA（M-TMV、CMV和PVY混合，N-空白對照）的種類PCR反應(yīng)電泳圖

3 小結(jié)

目前貴州煙區(qū)主要病毒病的鑒定是依靠癥狀表現(xiàn)，但是由于田間癥狀的差異性不明顯，加上相關(guān)寄主、介體昆蟲和復(fù)合侵染的廣泛存在，鑒定烤煙是否感染病毒以及確定病毒的種類都給經(jīng)驗(yàn)缺乏的煙農(nóng)和基層煙葉站人員增加了困擾。病毒檢測試紙條則大大提高了準(zhǔn)確性，如開陽在內(nèi)的部分分公司、煙葉站配置了試紙條，精確性非常高。但是在同時檢測大量癥狀類似的材料時，尤其是復(fù)合侵染材料檢測，成本就提高了，時間上的效率也下降?；旌蠘悠返臋z測技術(shù)就應(yīng)運(yùn)而生，這種利用混合引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件的PCR檢測方法在國內(nèi)外被廣泛報道，如檢測日本紅薯的4種RNA病毒[12]、匈牙利辣椒的3種RNA病毒[13]、我國西紅柿的6種病毒[14]與甘薯的3種RNA病毒[15]。在這些研究中，外殼蛋白都是重要的分子標(biāo)記，因?yàn)橥鈿さ鞍资遣《净蚪M的主要組成部分，也在很大程度上體現(xiàn)了病毒種類的多樣性[16]。我國烤煙生產(chǎn)中也先后開發(fā)了2套PCR檢測體系，分別針對3種[17]與5種[18]RNA病毒，而且2套檢測方法均涉及到了退火溫度與cDNA模板濃度的優(yōu)化，因而具有非常高的檢測精確性，而基層檢測站點(diǎn)往往不能達(dá)到相應(yīng)的工序要求。目前，貴州煙區(qū)還比較缺乏相關(guān)方面的研究。

本研究針對貴州煙區(qū)田間感染病毒的鮮煙葉樣品材料，靶向3種+ssRNA病毒（TMV、CMV和PVY）外殼蛋白基因，設(shè)計(jì)了3對特異性引物的混合體系與相同退火溫度（55?C）配套的PCR反應(yīng)程序，其中的6條引物全部是單義堿基。通過1次PCR反應(yīng)，就可以根據(jù)擴(kuò)增條帶的長度，一次性檢測RNA病毒的種類，可一次性檢測出復(fù)合侵染的2種病毒，也可以檢測出3種病毒cDNA混合物的種類，因而具備檢測出其他類型復(fù)合侵染的理論可能性。PCR反應(yīng)不需要調(diào)節(jié)DNA模板的濃度與退火溫度梯度，產(chǎn)生條帶的大小差異也很大，適合經(jīng)驗(yàn)不足的操作人員辨認(rèn)，整套工序利用基層檢測站點(diǎn)的PCR儀等設(shè)備就可以完成操作與識別。綜上所述，本套檢測方法非常適合基層檢測站點(diǎn)快速和高效地檢測大批量煙葉樣品，為后續(xù)的被侵染煙株的提早清除等病毒防控工作打下了基礎(chǔ)，積累的貴州煙區(qū)的數(shù)據(jù)也是我國花葉病研究的重要補(bǔ)充。