李永成， 祝強(qiáng)強(qiáng)， 王彥婷， 王 洋， 孫亞奇， 陸 斌*

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生化藥學(xué)教研室，上海 200433 2. 上海市第四人民醫(yī)院病理科，上海 200434 3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥劑科，上海 200433

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球癌癥死亡的第四大常見(jiàn)病種[1]，五年生存率僅為10%[2]。晚期肝癌患者喪失手術(shù)切除指征，只能進(jìn)行放化療，治療效果欠佳[3-4]。因此針對(duì)肝癌進(jìn)行特異性靶標(biāo)的篩選和生物靶向治療成為了研究熱點(diǎn)。Glypican-3(GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一員，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細(xì)胞膜表面。約70%的HCC存在GPC3表達(dá)[5]，而絕大多數(shù)正常成人組織及肝臟良性病變中沒(méi)有表達(dá)[6]。研究[7]還發(fā)現(xiàn)，GPC3在刺激細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。因此，GPC3作為一種肝癌特異性表達(dá)抗原，是肝癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

既往抗GPC3人源化抗體GC33的Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在晚期HCC患者中療效未達(dá)到預(yù)期，終止了臨床試驗(yàn)[8]?？笹PC3單域抗體HN3作為一種僅含單個(gè)重鏈可變區(qū)的特殊抗體，具有相對(duì)分子質(zhì)量小且易于滲透的特點(diǎn)，能發(fā)揮一定的抗肝癌效果[9]。將其與PE38等毒素融合構(gòu)建免疫毒素，可進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤活性[10]。將抗CD3 scFv和抗GPC3 scFv用短的Linker進(jìn)行連接構(gòu)建雙特異性T細(xì)胞銜接子(BiTE)，可有效募集T細(xì)胞靶向殺傷GPC3陽(yáng)性肝癌細(xì)胞[11]。但BiTE親和力低、純化困難和半衰期短的缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。

另外靶向GPC3的嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)免疫療法也是目前肝癌治療熱點(diǎn)之一，多個(gè)機(jī)構(gòu)開(kāi)展了臨床試驗(yàn)，其中一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明了其初步安全性[12]。但是發(fā)熱、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少和細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)等不良反應(yīng)以及個(gè)體化療法存在的高成本和批量生產(chǎn)的局限性，限制了其進(jìn)一步發(fā)展。

因此，本研究通過(guò)將抗GPC3 sdAb和抗CD3 sdAb相結(jié)合構(gòu)建抗GPC3/CD3 BiHcAb，一方面較傳統(tǒng)雙特異性抗體相對(duì)分子質(zhì)量小，易于滲透；另一方面加入IgG4 Fc段有利于提高穩(wěn)定性、便于純化。本研究主要初步評(píng)價(jià)其體內(nèi)外的抗肝癌效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1和Hep3B，人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431，HEK-293F，人淋巴瘤細(xì)胞Raji均由本實(shí)驗(yàn)室保存。A431-GW為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人GPC3的A431細(xì)胞。PMBC來(lái)源于健康人(海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)倫理審批號(hào)：NMUMREC-2021-050)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A431和A431-GW于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，Hep3B和SK-Hep-1于含15% FBS的MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，PBMC于10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件5%CO2、37℃、飽和濕度。HEK-293F細(xì)胞在無(wú)血清CD 293 TGE Medium培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件7%CO2、37℃，轉(zhuǎn)速115 r/min(r=2.5 cm)，飽和濕度。

1.3 載體構(gòu)建 委托金唯智生物公司全基因合成抗CD3和抗GPC3重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列參考WO2010037838A2和US9206257B2，通過(guò)密碼子優(yōu)化方式將其轉(zhuǎn)換為核酸序列；合成抗GPC3/CD3 BiTE序列，其氨基酸序列參考GC33和OKT3序列，C端加入6×His。二者序列分別以AgeⅠ、ApaⅠ和AgeⅠ、BamHⅠ插入pCMV-IgG4載體中。

1.4 抗體表達(dá)純化 將重組質(zhì)粒以PEI轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入HEK-293F細(xì)胞中，6～7 d后收集培養(yǎng)上清。BiHcAb通過(guò)Protein A柱進(jìn)行純化，BiTE通過(guò)鎳柱進(jìn)行純化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 收集細(xì)胞，將檢測(cè)抗體用5%的BSA稀釋到10 μg/mL，冰上孵育1 h，清洗2遍后，BiHcAb用Alexa Fluor 488標(biāo)記的Anti-human IgG抗體，BiTE用Alexa Fluor 488標(biāo)記的Anti-His Tag抗體，避光孵育45 min，再清洗2遍，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 以1×105個(gè)/孔的靶細(xì)胞與PBMC以1∶20的比例共培養(yǎng)并加入10 μg/mL抗體為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置效應(yīng)空白組、靶細(xì)胞空白組以及陽(yáng)性對(duì)照組，培養(yǎng)72 h后用CytoTox-Glo Cytotoicity Assay進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 ELISA檢測(cè) 采用森雄公司的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6的ELISA檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書檢測(cè)上述共培養(yǎng)體系中細(xì)胞培養(yǎng)上清中各細(xì)胞因子濃度。

1.8 裸鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞異體移植模型 每組4周齡雄性裸鼠5只，共5組，分別在其背部接種1×107個(gè)Hep3B細(xì)胞和1×108個(gè)PBMC。注射后0.5 h，尾靜脈注射含有相應(yīng)濃度的BiHcAb和BiTE抗體150 μL，以生理鹽水為陰性對(duì)照，連續(xù)5 d通過(guò)尾靜脈注射抗體。觀察21 d后處死小鼠，期間測(cè)量腫瘤直徑大小，并計(jì)算腫瘤體積=(長(zhǎng)×寬2)/2。

2 結(jié) 果

2.1 抗GPC3/CD3雙特異性重鏈抗體的構(gòu)建與表達(dá) 將全基因合成的抗GPC3和抗CD3的單域抗體VHH序列以AgeⅠ和ApaⅠ酶切位點(diǎn)克隆至含IgG4 Fc段(包括野生型、Knob或Hole突變體)的表達(dá)載體pCMV-IgG4中，雙酶切篩選獲得正確克隆(圖1A)。同時(shí)將抗GPC3/CD3 BiTE序列以AgeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pCMV中。轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞，搖瓶中懸浮培養(yǎng)進(jìn)行表達(dá)。純化濃縮后，進(jìn)行蛋白電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示：抗GPC3 HcAb、抗CD3 HcAb、抗GPC3/CD3 BiHcAb的相對(duì)分子質(zhì)量約100 000，還原狀態(tài)下相對(duì)分子質(zhì)量約40 000；抗GPC3/CD3 BiTE的相對(duì)分子質(zhì)量約為50 000(圖1B)，提示成功構(gòu)建了4種抗體。

圖1 重鏈抗體和BiTE真核表達(dá)載體的構(gòu)建和蛋白表達(dá)檢測(cè)

2.2 重鏈抗體與細(xì)胞表面相關(guān)抗原的結(jié)合能力 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)：抗GPC3重鏈抗體能夠與內(nèi)源性表達(dá)GPC3的Hep3B細(xì)胞和過(guò)表達(dá)GPC3的A431-GW細(xì)胞相結(jié)合，而不能與不表達(dá)GPC3的SK-Hep-1和A431細(xì)胞結(jié)合；抗CD3重鏈抗體能夠與PBMC結(jié)合，而與不表達(dá)CD3的Raji細(xì)胞不結(jié)合。結(jié)果提示前期構(gòu)建的重鏈抗體具有與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的結(jié)合能力。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重鏈抗體與細(xì)胞表面蛋白的結(jié)合

2.3 雙特異性重鏈抗體與細(xì)胞表面相關(guān)抗原的結(jié)合能力 結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，抗GPC3/CD3 BiHcAb既能與內(nèi)源性表達(dá)GPC3的Hep3B細(xì)胞和過(guò)表達(dá)GPC3的A431-GW細(xì)胞相結(jié)合，也能與PBMC結(jié)合，而與不表達(dá)GPC3的SK-Hep-1和A431細(xì)胞不結(jié)合，也與不表達(dá)CD3的Raji細(xì)胞不結(jié)合(圖3A)；而抗GPC3/CD3 BiTE也具有相似的結(jié)合能力(圖3B)。結(jié)果表明構(gòu)建的BiHcAb和BiTE都具有與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的結(jié)合作用。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雙特異性抗體與細(xì)胞表面蛋白的結(jié)合

2.4 雙特異性重鏈抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用 將靶細(xì)胞、PBMC和抗GPC3/CD3 BiHcAb(抗GPC3/CD3 BiTE、抗GPC3 HcAb或抗CD3 HcAb)共孵育72 h，細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)：BiHcAb在表達(dá)GPC3的A431-GW和Hep3B細(xì)胞中的殺傷率分別是(43.1±9.0)%和(55.5±7.6)%，顯著高于BiTE組的殺傷率(5.3±10.1)%和(11.0±2.8)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；也顯著高于BiHcAb在不表達(dá)GPC3的A431和SK-Hep-1細(xì)胞的殺傷率(11.1±7.6)%和(12.6±1.3)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 雙特異性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)

2.5 雙特異性重鏈抗體介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放 結(jié)果(圖5)表明：BiHcAb在表達(dá)GPC3的A431-GW細(xì)胞上清中誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6的表達(dá)量分別為(936.3±20.9)、(1 178.2±35.8)、(854.1±81.0)和(818.8±25.2) pg/mL，顯著高于BiTE組，分別為(542.1±74.0)、(294.5±28.1)、(460.3±36.0)和(620.0±12.1) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 同樣在內(nèi)源性表達(dá)GPC3的Hep3B細(xì)胞中，BiHcAb誘導(dǎo)IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6的表達(dá)量分別為(840.3±50.3)、(956.5±49.0)、(870.0±53.0)和(951.3±136.4) pg/mL，顯著高于BiTE組，分別為(386.2±27.1)、(362.0±22.7)、(542.5±33.7)和(505.1±26.1) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 雙特異性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放

2.6 雙特異性重鏈抗體體內(nèi)抑制裸鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 裸鼠種植實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明：與NS組相比，高低濃度BiHcAb組均能顯著抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)(P<0.01)，且也顯著優(yōu)于BiTE組(P<0.05)。與NS組相比，BiTE高濃度組可抑制肝癌生長(zhǎng)(P<0.05)，但低濃度組作用不顯著。當(dāng)?shù)?1天時(shí)，各組裸鼠未出現(xiàn)惡液質(zhì)表現(xiàn)，但因腫瘤體積大于1 000 mm3，實(shí)驗(yàn)終止，處死裸鼠，稱量體質(zhì)量，NS組、2 μg BiHcAb組、20 μg BiHcAb組、1 μg BiTE組和10 μg BiTE組的體質(zhì)量分別為(25.8±1.5)、(25.4±1.8)、(25.7±3.0)、(26.2±2.2)和(26.5±1.9) g。分離腫瘤組織，觀察發(fā)現(xiàn)GPC3/CD3 BiHcAb組裸鼠腫瘤平均直徑小于其他組別，提示BiHcAb具有良好的抗腫瘤活性。

圖6 雙特異性抗體體內(nèi)抑制裸鼠肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)

3 討 論

GPC3作為一種肝癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的糖蛋白，被認(rèn)為是肝癌靶向治療的重要標(biāo)志物，成為近年來(lái)肝癌診治研究的熱點(diǎn)。研究表明GPC3特異性抗體在肝癌的治療和診斷中具有重要的作用；同時(shí)靶向GPC3的免疫細(xì)胞治療如CAR-T細(xì)胞治療也已進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。

然而目前CAR-T治療還處于發(fā)展階段，部分關(guān)鍵問(wèn)題如細(xì)胞因子釋放綜合征、通用型CAR-T的制備及其在實(shí)體瘤的治療等方面都還未得到很好的解決，而且個(gè)體化療法所帶來(lái)的高昂治療費(fèi)用是一般家庭難以承受的。

靶向人CD3/腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的BiTE可作為抗腫瘤治療的重要手段。BiTE作用的發(fā)揮必須同時(shí)與T細(xì)胞表面的CD3和腫瘤細(xì)胞上的TAA相結(jié)合，然后激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞毒活性，釋放眾多細(xì)胞因子，從而發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[13]。BiTE具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易穿透腫瘤組織、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)[14]，但其缺乏Fc段，易在體內(nèi)被快速消除，血液半衰期較短，僅為1.25 h左右，因此需要持續(xù)推注或者一天內(nèi)多次輸注以維持血藥濃度[15]。目前僅有一種靶向CD19/CD3的BiTE博納吐單抗(Blinatumomab)，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療急性淋巴細(xì)胞性白血病。

20世紀(jì)90年代初，Hamers-Casterman等[16]偶然從駱駝中發(fā)現(xiàn)了一種缺乏輕鏈、僅有重鏈的抗體，稱為重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HcAbs)，其單個(gè)重鏈可變區(qū)(VHH)即具有與抗原的結(jié)合能力，又被稱為納米抗體(Nanobody)。不同于VH中包含一個(gè)面向VL的疏水面，VHH是完全親水的結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性和溶解度優(yōu)于VH。VHH的CDR3區(qū)通常比常規(guī)抗體VH的CDR3長(zhǎng)，可形成指狀延伸，以觸及常規(guī)抗體無(wú)法到達(dá)的抗原表位；同時(shí)長(zhǎng)的CDR3可增大與抗原的相互作用面，部分補(bǔ)償了VL缺失帶來(lái)的影響[17]。

本研究通過(guò)構(gòu)建抗GPC3/CD3 BiHcAb，發(fā)揮其類似BiTE的功能，以分別結(jié)合T細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，隨之激活T細(xì)胞發(fā)揮殺傷肝癌細(xì)胞的作用。同時(shí)重鏈抗體比完整抗體小、易于滲透，且因含F(xiàn)c段，比BiTE的穩(wěn)定性高，純化更為方便。研究結(jié)果表明BiHcAb在體外實(shí)驗(yàn)中針對(duì)GPC3陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷率約為50%，遠(yuǎn)高于BiTE的殺傷(約10%)。同時(shí)BiHcAb誘導(dǎo)釋放的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6等細(xì)胞因子的水平也高于BiTE組。這一方面由于BiHcAb帶有Fc段，其穩(wěn)定性優(yōu)于BiTE；另一方面由于與CD3和TAA抗原表位結(jié)合的VHH結(jié)構(gòu)域比BiTE中的scFv部分更小，可能使腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞在空間上更為靠近，導(dǎo)致能夠更好地持續(xù)性激活T細(xì)胞，釋放更多的細(xì)胞因子，最終發(fā)揮更好的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。在裸鼠體內(nèi)移植瘤模型中，本研究進(jìn)一步觀察了不同濃度抗GPC3/CD3 BiHcAb和抗GPC3/CD3 BiTE對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制效果，發(fā)現(xiàn)高低濃度BiHcAb組均具有較明顯的腫瘤抑制效果，而低濃度BiTE組抑制效果不明顯。結(jié)合體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)，本研究初步證實(shí)BiHcAb較之BiTE具有更好的抗腫瘤活性。然而本研究?jī)H初步評(píng)價(jià)了抗GPC3/CD3 BiHcAb的體內(nèi)外抗肝癌作用，以驗(yàn)證本BiHcAb模型在腫瘤治療中的有效性。下一步還將深入探討該抗體的作用和具體機(jī)制，為將來(lái)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。