孔金玉，王 健，劉怡文，孫 蔚，原 翔，高社干

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在中國90%以上為鱗狀細(xì)胞癌[1-2]，而目前的預(yù)防及治療手段欠佳，多數(shù)患者仍不能得到有效控制，5 a生存率很低[3]。維生素D(vitamin D，VD)是一種與人體健康密切相關(guān)的脂溶性維生素。長期以來，人們對(duì)VD的研究主要集中在鈣、磷代謝的調(diào)節(jié)作用，近年來，VD在抗腫瘤方面的研究受到越來越多的關(guān)注。大量研究表明，VD及其類似物可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗血管生成等方式發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。VD發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的受體是廣泛分布于體內(nèi)諸多組織內(nèi)的VD受體(vitamin D receptor，VDR)。目前，VDR與腫瘤的研究主要集中在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等[5-7]，關(guān)于VDR在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平及與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究擬采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)食管鱗癌組織中VDR的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系，探討VDR在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為回顧性研究，收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年1月至2014年12月具有明確病理學(xué)診斷的原發(fā)性食管鱗癌患者組織標(biāo)本114例，其中男73例，女41例；年齡40～73歲，中位年齡61歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者56例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期66例，Ⅲ期48例。另取其中50例手術(shù)切除的癌旁組織作為對(duì)照，全部標(biāo)本收集后立即于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol LS Reagent及TaqMan Expression Kit(美國，Invitrogen)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、0.1 mM DTT、5×First Buffer、RNase Inhibitor和GADPH(美國，Applied Biosystems)。NanoDrop ND1000紫外可見分光光度計(jì)(美國，Thermo)，7900HT熒光定量PCR(美國，Applied Biosystems)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)VDR mRNA的表達(dá)水平取食管癌或癌旁組織標(biāo)本100～200 mg，液氮中研磨成粉末狀；加入1 mL的TRIzol，混合均勻；加入200 μL氯仿，12 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；加入等體積異丙醇，-20 ℃放置2 h；12 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇，洗滌RNA，混勻；12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min；重復(fù)洗滌1次；NanoDrop紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度；1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA是否降解；稀釋至工作濃度(50 ng·μL-1)，-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，總反應(yīng)體系為12 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃15 min。cDNA 樣本在-20 ℃保存。按照TaqMan mRNA Assays的說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。每個(gè)PCR 反應(yīng)體系為5 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；40個(gè)循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參，Log10(2-ΔΔCt)表示VDR mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪根據(jù)病歷信息進(jìn)行隨訪，死于其他疾病、失訪或隨訪截止時(shí)間仍存活視為截尾數(shù)據(jù)。114例患者中死亡66例，均死于食管癌相關(guān)的并發(fā)癥或復(fù)發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；總生存期(overall survival, OS)定義為確診日期至死亡日期或最近一次隨訪日期(2020年12月)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Log10(2-ΔΔCt)計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，mRNA在癌和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，VDR mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)生存時(shí)間的差異。α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR mRNA在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)水平應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)50例食管鱗癌及相應(yīng)的癌旁組織中VDR mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，VDR mRNA在食管鱗癌組織中平均表達(dá)水平(5.39 ± 0.52)低于癌旁組織(5.92 ± 0.54)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.958，P<0.05)。見圖1。

圖1 VDR mRNA在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 VDR mRNA表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析進(jìn)一步檢測(cè)VDR在114例食管鱗癌中的表達(dá)，利用VDR mRNA表達(dá)的中位值(5.550)將患者分成高表達(dá)、低表達(dá)兩組。如表1所示，VDR基因表達(dá)水平和性別(χ2=6.437，P=0.011)、吸煙(χ2=3.947，P=0.047)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=5.054，P=0.025)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 食管鱗癌組織中VDR mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 VDR mRNA表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存時(shí)間的差異，分析VDR mRNA表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性，圖2結(jié)果顯示，114例食管鱗癌患者術(shù)后VDR mRNA高表達(dá)組中位生存期為65.5個(gè)月，明顯高于低表達(dá)組(22.7個(gè)月)，提示VDR mRNA高表達(dá)與食管鱗癌患者生存預(yù)后較好有關(guān)(χ2=4.906，P=0.027)。

圖2 食管鱗癌中VDR mRNA高表達(dá)與低表達(dá)的生存曲線

3 討論

維生素D是一種脂溶性的類固醇衍生物，在骨代謝和鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，VD具有潛在的抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞分化等。除此之外，VD還參與調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥等多個(gè)生物學(xué)過程[8]。VDR廣泛分布于小腸、腎、骨、皮膚、甲狀旁腺、結(jié)腸、乳腺、胰腺等正常組織中，同時(shí)也表達(dá)于這些組織的癌細(xì)胞中[9]。VD的生物學(xué)功能是通過與VDR結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)游離的1,25(OH)2D3進(jìn)入細(xì)胞后被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與VDR結(jié)合并使VDR發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致VDR構(gòu)象的改變，進(jìn)而與類視黃醇X受體(retinoid X recepto，RXR)結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，VD-VDR復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄因子，作用于其靶基因啟動(dòng)區(qū)中的特異DNA序列(維生素D反應(yīng)元件，vitamin D responsive element，VDRE)，從而激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[10]。

VDR表達(dá)于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，包括食管癌。既往VDR和食管癌的研究主要為腺癌，在食管腺癌中VDR表達(dá)水平隨著腫瘤去分化而下降。與食管正常鱗狀上皮相比，VDR在Barrett食管黏膜中的表達(dá)顯著升高[11-12]。在食管鱗癌細(xì)胞中VDR基因多態(tài)性和不良預(yù)后相關(guān)[13]。Mimori K等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管組織相比，VDR在食管癌組織中表達(dá)較低，其低表達(dá)與預(yù)后較差相關(guān)，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤侵襲及血行擴(kuò)散能力增強(qiáng)。該研究提示VDR表達(dá)下調(diào)可能在食管癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，而VDR基因表達(dá)上調(diào)具有改善食管癌預(yù)后的潛在可能。另外，相關(guān)體外及動(dòng)物模型研究表明，VD能抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]。

本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)VDR mRNA在食管鱗癌中的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)VDR mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著低于相應(yīng)的癌旁組織。VDR mRNA低表達(dá)與預(yù)后較差、生存時(shí)間較短相關(guān)。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。除此之外，VDR mRNA表達(dá)與食管癌患者性別、吸煙及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示VDR mRNA低表達(dá)在食管癌患者中男性多于女性，吸煙患者多于非吸煙患者，VDR mRNA低表達(dá)患者易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究表明VDR mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且其表達(dá)與患者的臨床病理類型及預(yù)后密切相關(guān)。VDR有望成為食管鱗癌預(yù)后的判斷指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn)。