姬廣超，王曉明，劉 倩，蘇苗苗，王玉琪

（上海安庫生醫(yī)生物科技有限公司，上海 201318）

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，具有自我更新和多向分化的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞多被應(yīng)用于下肢缺血性疾病、心肌梗死、I型糖尿病、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病、肝損傷疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病、眼部疾病等多種疾病的治療及造血干細(xì)胞移植中。最初，骨髓是人類間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源。隨著時間推移，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可從脂肪組織、牙組織、皮膚及包皮、唾液腺、胎兒肢芽、經(jīng)血和圍產(chǎn)期組織等多種組織中分離出來[1]。圍產(chǎn)期組織中的臍帶組織是分娩胎兒后產(chǎn)生的一種廢棄物。臍帶組織中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，且具有獲取方便、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)勢。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞治療藥物研究中的熱點(diǎn)。截至2020年10月底，在國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心公布的藥物臨床試驗(yàn)受理目錄中，干細(xì)胞（不包括干細(xì)胞因子）治療用生物制品臨床試驗(yàn)申請有27項(xiàng)（不區(qū)分申請類型），其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療用生物制品臨床試驗(yàn)申請有14項(xiàng)。以往，多使用胎牛血清、動物來源的胰蛋白酶等動物來源成分培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。用此法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有異種蛋白免疫原性風(fēng)險及潛在的病毒傳播風(fēng)險。2017年，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出：“細(xì)胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)盡量避免使用動物或人來源的物質(zhì)，比如應(yīng)盡量避免血清的使用，若必須使用血清，需要提供相關(guān)的研究資料說明使用的必要性和合理性；嚴(yán)禁使用疫病流行區(qū)來源的動物血清；不得使用未經(jīng)過安全性驗(yàn)證的血清?！北狙芯渴褂脽o動物來源成分的血清替代物EliteGroTM-Adv替換胎牛血清、無動物來源成分的重組酶TrypLETMExpress替換動物來源的胰蛋白酶組成的無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并鑒定采用該方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的效果。

1 儀器與試劑

本文中使用的儀器為博迅公司生產(chǎn)的高壓滅菌鍋、Heal Force公司生產(chǎn)的A2型生物安全柜、Heal Force公司生產(chǎn)的二氧化碳培養(yǎng)箱、貝克曼公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀及湘儀公司生產(chǎn)的離心機(jī)。本文中使用的試劑為Elitecell公司生產(chǎn)的EliteGroTM-Adv、達(dá)科為公司生產(chǎn)的MSCBM、Thermo Scientific公司生產(chǎn)的TrypLETMExpress、埃澤思公司生產(chǎn)的無血清細(xì)胞凍存液及安徽雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)的生理鹽水。

2 方法

2.1 組織處理

選擇產(chǎn)前艾滋、梅毒、乙肝及丙肝傳染四項(xiàng)檢查結(jié)果呈陰性的供體，在孕產(chǎn)婦分娩胎兒后，獲取其廢棄的臍帶組織。使用生理鹽水清洗3遍臍帶組織，將其剪成長2～3 cm的小段。撕去臍帶組織的外皮和內(nèi)部的三根血管，使用生理鹽水清洗臍帶組織，將其剪成大小為1～3 mm3的小塊。將臍帶組織擺放至100 mm的培養(yǎng)皿中，每塊臍帶組織的間距為0.5 mm。將培養(yǎng)皿倒置30 min后，擺正培養(yǎng)皿。向培養(yǎng)皿中加入2～3 mL的完全培養(yǎng)基（含濃度為5%的血清替代物MSCBM），潤濕每塊臍帶組織。靜止24 h后，向培養(yǎng)皿中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，覆蓋每塊臍帶組織。每3天為培養(yǎng)皿更換1次完全培養(yǎng)基。

2.2 消化傳代

當(dāng)大部分的臍帶組織邊緣有間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，且培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的匯合度為70%～90%時，對其進(jìn)行消化處理。輕輕晃動培養(yǎng)皿，使臍帶組織塊脫離培養(yǎng)皿底部，棄去上清液（含臍帶組織塊）。使用生理鹽水清洗1～2遍培養(yǎng)皿。向培養(yǎng)皿中加入TrypLETMExpress至覆蓋臍帶組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的表面。在37℃的環(huán)境下，對臍帶組織進(jìn)行5～8 min的消化處理。5～8 min后，向培養(yǎng)皿中加入等體積的生理鹽水，終止消化程序。收集細(xì)胞懸液，對其進(jìn)行離心處理后計(jì)數(shù)，將其以5000～8000個/cm2/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中。細(xì)胞若為凍存后復(fù)蘇細(xì)胞，可適當(dāng)提高其接種密度。當(dāng)培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的匯合度為80%時，對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3 收獲凍存

將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至目標(biāo)代次時，收獲臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。收獲后計(jì)數(shù)，取樣送檢。使用無血清細(xì)胞凍存液按照規(guī)定濃度將其余臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存于氣相液氮罐中。

2.4 細(xì)胞表型檢測

使用流式細(xì)胞儀檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中CD73分子、CD90分子、CD105分子、CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子等標(biāo)志物的表達(dá)。

2.5 細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測

向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的胎牛血清、1 μM的地塞米松、0.5 mM的IBMX、50 μg/mL的吲哚美辛及10 μg/mL的胰島素，將其配制成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的胎牛血清、0.1 μM的地塞米松、50 μg/mL的L-抗壞血酸及10 mM的β-甘油磷酸鈉，將其配制成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（100x）和10 ng/mL的轉(zhuǎn)化生長因子β1，將其配制成成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將待測的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照2×104個/cm2/mL的密度接種于12孔培養(yǎng)板中。向每個接種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的孔中加入1 mL的完全培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的匯合度為80%～100%時，去除培養(yǎng)板孔中的完全培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板孔中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每隔2～3天更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3周后，使用油紅O染色法對成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，使用茜素紅染色法對成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，使用阿爾新藍(lán)染色法對成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

當(dāng)臍帶組織塊貼壁后，其組織邊緣開始有間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁爬出。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的爬出速度因供體不同而存在差異。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的爬出速度較快時，在培養(yǎng)后第3天即可見臍帶組織中開始有間充質(zhì)干細(xì)胞爬出。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的爬出速度較慢時，在培養(yǎng)后第9天才可見臍帶組織中開始有間充質(zhì)干細(xì)胞爬出。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形貼壁爬出，進(jìn)行傳代后3～4天即可長滿整個培養(yǎng)容器，其增殖倍數(shù)為3～8倍。詳見圖1。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

3.2 細(xì)胞表型檢測的結(jié)果

對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表型檢測的結(jié)果顯示其中CD73分子、CD90分子及CD105分子呈高表達(dá)（陽性率≥95%）；其中CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子呈低表達(dá)（陽性率≤2%），甚至不表達(dá)。詳見表1、圖2。

圖2 細(xì)胞表型檢測的結(jié)果

表1 細(xì)胞表型檢測的結(jié)果（%）

3.3 細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果

對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果顯示其具有成脂、成骨及成軟骨的能力。詳見圖3。

圖3 細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果（從左至右依次為進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化染色的結(jié)果）

4 討論

2006年，國際細(xì)胞治療協(xié)會提出了鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)：首先，在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下，其在塑料培養(yǎng)容器上貼壁生長；其次，CD73分子、CD90分子及CD105分子的陽性率≥95%，CD45分子、CD34分子、CD14分子或CD11b分子、CD79α分子或CD19分子及HLA-DR分子的陽性率≤2%；最后，其在體外具有分化成為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的能力[2]。2005年，Doucet等提出血小板裂解物可作為動物血清的替代品用于間質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。Becherucci V等[3]證實(shí)，血小板裂解物可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，不影響其免疫表型、免疫調(diào)節(jié)能力、分化潛能及端粒相對長度。李炳堯等[4]認(rèn)為，人血小板裂解液培養(yǎng)基可以滿足臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與擴(kuò)增的需求，而且較于胎牛血清培養(yǎng)基，人血小板裂解液培養(yǎng)基在用于大規(guī)模擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞方面有明顯的優(yōu)勢。TrypLETMExpress是一種無動物來源成分的重組酶。Tsuji K等[5]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TrypLETMExpress可在5 min內(nèi)快速消化間充質(zhì)干細(xì)胞，且消化30 min內(nèi)不影響間充質(zhì)干細(xì)胞的表型。本文使用由無動物來源成分的血清替代物替代胎牛血清、無動物來源成分的重組酶替代動物來源的胰蛋白酶及無血清細(xì)胞凍存液組成的無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并對培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，使用無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量完全滿足國際細(xì)胞治療協(xié)會提出的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量的最低標(biāo)準(zhǔn)，且可大量擴(kuò)增。

綜上所述，使用無動物來源成分培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量完全滿足國際細(xì)胞治療協(xié)會提出的評估間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量的最低標(biāo)準(zhǔn)。使用該方案生產(chǎn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可極大地提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床研究和臨床應(yīng)用的安全性，能夠?yàn)橄嚓P(guān)細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、研究與應(yīng)用提供一個優(yōu)選方案。