白青山， 宋鵬， 于艷， 高慧

(1.唐山市婦幼保健院 消化內科， 河北 唐山 063000；2.唐山市婦幼保健院 兒內科， 河北 唐山 063000； 3.唐山市婦幼保健院 內科， 河北 唐山 063000)

近年來，我國兒童肥胖發(fā)病率逐年增加，已成為公共衛(wèi)生的一大挑戰(zhàn)[1]。肥胖與多數(shù)疾病密切相關，如肥胖相關腎病、糖尿病及非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)等[2]。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染與肥胖關系密切，二者相互作用可調節(jié)胰島素抵抗、炎癥因子、脂質代謝及腸道菌群等參與NAFLD發(fā)病及進展[3]。NAFLD是一種以肝臟細胞脂肪變性為特征的臨床綜合癥，若不及時進行干預，極易發(fā)展為肝纖維化、肝硬化等[4]，探究Hp陽性肥胖患者并發(fā)NAFLD的機制、預判并發(fā)NAFLD的生物標志物具有重要意義。網狀蛋白1C(reticulin 1C，RTN-1C)是一種主要存在于內質網膜上的網狀蛋白，可調節(jié)內質網結構和功能[5-6]。有研究報道RTN-1C過表達可激活細胞自噬，干擾其表達則可抑制細胞自噬[7]。脂噬是一種選擇性自噬，可選擇性識別脂質并將其降解，從而維持細胞正常的脂質穩(wěn)態(tài)，已被證實與肥胖、NAFLD有關[8]，關于RTN-1C與Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD關系的研究較缺乏。因此，本研究觀察RTN-1C在Hp陽性肥胖患兒外周血單個核細胞中的水平，分析其與并發(fā)NAFLD及其嚴重程度的關系，探究RTN-1C在Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年1月—2020年5月本院就診的Hp陽性肥胖患兒作為研究對象，均符合《中國學齡兒童青少年超重、肥胖篩查體質量指數(shù)值分類標準》[9]中肥胖診斷標準[體質量指數(shù)(body mass index，BMI)高于同年齡、性別的兒童的第95百分位數(shù)]并經13C-尿素呼氣試驗檢查確診為Hp陽性。排除以下情況：應用影響血脂、血糖或肝功能藥物；下丘腦、垂體或甲狀腺異常引起的肥胖；糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L；肝、腎功能異常(NAFLD除外)；伴惡性腫瘤；有飲酒史。納入Hp陽性肥胖患兒206例，男123例、女83例，年齡7～14歲、中位年齡10歲。參照《兒童非酒精性脂肪肝病診斷與治療專家共識》[10]診斷NAFLD，根據是否并發(fā)NAFLD將206例Hp陽性肥胖患兒分為非NAFLD組(n=63)和NAFLD組(n=143)，2組患兒的基線資料見表1。本研究入組的所有患兒的監(jiān)護人簽署了知情同意書，本研究經唐山市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準(2019-015-001)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 收集所有患兒年齡、性別、BMI、疾病史、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)等資料，同時計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resist，HOMA-IR，計算公式 HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)[11]。

1.2.2NAFLD嚴重程度判定 根據B超結果判斷NAFLD組患兒嚴重程度，包括：(1)肝臟輕中度腫大且邊緣角圓鈍;(2)肝臟內管道結構不清晰;(3)肝臟內血流信號減弱但血管走向正常;(4)肝區(qū)進場回聲彌漫性增強、遠場回聲逐漸減弱；具備任1項定義為輕度，任2項定義為中度，具備任2項且肝右葉包膜和橫膈回聲顯示不清或不完整定義為重度[12]。

1.2.3外周血單個核細胞中RTN-1C水平檢測 采用Ficoll密度梯度離心法[13]分離外周血中單個核細胞?；純焊闻KB超檢查當日抽取空腹肘部靜脈血10 mL，磷酸鹽緩沖溶液稀釋，置于Ficoll分離液中低溫環(huán)境下2 000 r/min 離心20 min，吸取外周血單個核細胞層，用磷酸鹽緩沖溶液重懸細胞，1 500 r/min離心10 min，重復上述操作2次，吸取單個核細胞。用蛋白質免疫印跡法[14]檢測單個核細胞中RTN-1C水平：用放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液裂解單個核細胞，獲取總蛋白，用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒定量；用10%SDS-PAGE分離膠電泳，120 V至溴酚藍跑出膠面，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；兔抗人RTN-1C單克隆抗體(1 ∶1 000，武漢維克賽斯科技有限公司，批號07521)4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗(1 ∶5 000，北京百奧萊博科技有限公司，批號0590)室溫下孵育1 h；用化學底物發(fā)光液曝光顯影，用Image J軟件讀取實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 基線資料

2組Hp陽性肥胖患兒在年齡、性別、BMI、TG和HDL-C水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。NAFLD組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C、ALT及AST水平均高于非NAFLD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 非NAFLD組和NAFLD組Hp陽性患兒基線資料的比較

2.2 RTN-1C水平

NAFLD組Hp陽性患兒外周血RTN-1C水平低于非NAFLD組，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.984，P<0.001)。見圖1。

注：A為蛋白質免疫印跡法檢測結果，B為外周血RTN-1C水平定量結果；(1)與非NAFLD組比較，P<0.001。

2.3 Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的相關因素分析

應用lasso回歸篩選自變量，選取λ最小值時，進入模型的自變量有BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C；將Hp陽性肥胖患兒是否并發(fā)NAFLD作為因變量，BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C作為自變量納入多因素Logistic回歸分析。結果顯示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨立危險因素(P<0.05)，RTN-1C是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨立保護因素(P<0.05)。見表2。

表2 Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的Logistic回歸分析

2.4 RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的關系

RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的ROC曲線下面積、最佳截斷點、敏感度和特異度分別為0.923(95%CI為0.878～0.956)、0.86、77.62%和96.83%(圖2)。用限制性立方樣條擬合Logistic回歸分析RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的關系，當節(jié)點個數(shù)為3時，AIC值最小(AIC=134.278)，分析結果顯示RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD有關(χ2=46.69，P<0.001)，且呈線性關系(非線性檢驗χ2=2.65，P=0.103)。以RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的最佳截斷點做為參考點，當RTN-1C<0.86時，并發(fā)NAFLD風險增加；當RTN-1C>0.86時，并發(fā)NAFLD風險降低(圖3)。

圖2 RTN-1C診斷Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的ROC曲線

圖3 RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的限制性立方樣條圖

2.5 RTN-1C與NAFLD嚴重程度的關系

輕度(n=62)、中度(n=50)和重度(n=31)NAFLD患兒RTN-1C水平分別為(0.89±0.11)、(0.80±0.08)和(0.71±0.07)，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=44.745，P<0.001)。輕度NAFLD患兒RTN-1C水平分別高于中度和重度NAFLD患兒，差異均有統(tǒng)計學意義(q=7.289、13.162，P<0.01)；中度NAFLD患兒RTN-1C水平高于重度NAFLD患兒，差異有統(tǒng)計學意義(q=6.604，P<0.01)；NAFLD患兒RTN-1C水平與NAFLD嚴重程度呈負相關關系(r=-0.671，P<0.001)。

3 討論

長期Hp感染會導致胰島素抵抗及炎癥反應，易誘發(fā)肥胖和NAFLD[15]。此外，肥胖患者多伴有胰島素抵抗、游離脂肪酸增多、炎癥因子及脂肪細胞因子代謝紊亂等，上述因素均在NAFLD發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[16]。因此，Hp陽性肥胖患兒更易并發(fā)NAFLD。外周血單個核細胞中相關蛋白或基因與肝臟疾病密切相關，可在一定程度上反映肝臟的脂肪變性、炎癥等程度[17-18]。本研究通過比較非NAFLD組和NAFLD組Hp陽性肥胖患兒外周血單個核細胞中的RTN-1C水平，結果顯示NAFLD組Hp陽性肥胖患兒RTN-1C水平低于非NAFLD組，該結果提示RTN-1C或許與Hp陽性肥胖并發(fā)NAFLD有關。

既往研究表明FBG、TC、LDL-C及ALT均是NAFLD發(fā)病的獨立危險因素[19-24]。為避免混雜因素影響，本研究對血糖水平做了一定限制，未將糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L的患兒納入研究，以避免上述因素影響本研究分析結果。采用多因素Logistic回歸分析影響Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的相關因素，結果顯示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨立危險因素，與上述文獻結果一致。本研究結果還顯示RTN-1C是Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD的獨立保護因素。此外，限制性立方樣條擬合多因素Logistic回歸分析結果還顯示當RTN-1C<0.86時，并發(fā)NAFLD風險增加；當RTN-1C>0.86時，并發(fā)NAFLD風險降低。RTN-1C在細胞自噬調節(jié)中起著關鍵作用，其不僅可調節(jié)自噬體積累，還可調節(jié)LC3水平，促進自噬小體形成[25]。此外，RTN-1C還可靶向內質網應激通路調節(jié)線粒體形態(tài)及活性，促進線粒體相關內質網膜形成，加速線粒體和內質網之間的脂質交換[7]。推測RTN-1C表達水平高，更能激活細胞脂噬，從而將細胞內多余脂質降解，維護細胞的脂質穩(wěn)態(tài)，外周血單個核細胞中RTN-1C表達水平可反映脂噬程度，進而反映肝臟內脂肪變性程度。

本研究比較了輕、中、重度NAFLD患兒外周血單個核細胞中RTN-1C表達水平，結果顯示隨NAFLD病情加重，外周血單個核細胞中RTN-1C表達水平逐漸降低，且與NAFLD嚴重程度呈負相關關系，上述結果均表明RTN-1C與NAFLD進展有關，但關于其病理生理機制仍需開展基礎研究進一步證實。

綜上所述，RTN-1C與Hp陽性肥胖患兒并發(fā)NAFLD有關，檢測其水平有利于判斷NAFLD發(fā)病情況，RTN-1C表達水平低提示并發(fā)NAFLD風險較高，RTN-1C與NAFLD嚴重程度呈負相關關系。本研究上存在一定不足，一是納入研究樣本量偏小，且為單中心研究；二是在樣本選取上存在一定偏倚，上述不足均可能影響分析結果，因此下一步將開展大樣本、多中心研究以彌補上述不足。