羅婷， 張藝凡， 楚蘭， 陳美秋， 夏聰， 徐凱翎， 劉磊

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導、細胞免疫依賴、補體參與的累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無力和易疲勞性[1]。目前對MG尚無有效根治方法，需要長期隨訪并及時調(diào)整治療方案，使患者病情達到由美國重癥肌無力基金協(xié)會(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)制定的干預后狀態(tài)(post-intervention status，PIS)分類中的最輕微表現(xiàn)狀態(tài)(minimal manifestation status，MMS)或更好[1]。但因MG發(fā)病機制不明確，尚缺少有效的觀察指標來指導臨床診療方案。目前研究表明，MG主要的發(fā)病機制可能與機體的自身免疫平衡被打破，尤其是淋巴細胞亞群比例的失衡有關[2]，在部分MG患者胸腺中還存在部分異常具有抗乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)的CD4+T細胞，能促進B淋巴細胞活化和生成AChR-Ab[3]。CD8+作為要主要組織相容性復合體Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC Ⅰ)類限制性T細胞識別輔助受體，具有抑制T細胞活性和B細胞產(chǎn)生抗體的作用，可作為免疫調(diào)節(jié)的標志物[4]。自然殺傷(natural killer，NK)細胞具有獨立生物活性，參與細胞免疫，在腫瘤、病毒感染等疾病中其重要作用，具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)NK存在潛在調(diào)節(jié)T細胞活化能力，在實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，NK細胞能激活機體CD4+淋巴細胞來輔助活化后的B淋巴細胞分泌AChR-Ab[3]。國內(nèi)外文獻對淋巴細胞與MG病情的相關性研究相對較少，因此本研究以90例MG患者作為研究對象，探討MG患者淋巴細胞亞群與病情嚴重程度和AChR-Ab陽性率的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年4月—2018年12月醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的MG患者90例，要求符合《中國重癥肌無力診斷和治療中國專家共識》[6]中MG的診斷標準、新斯的明實驗陽性、肌電圖檢查及臨床表現(xiàn)確診，為首次發(fā)病或穩(wěn)定后復發(fā)者；排除近3個月使用過激素、免疫抑制劑等，排除合并嚴重的代謝性或其他免疫性疾病，排除合并急慢性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，HIV)等感染性疾病，排除嚴重的心肝腎功能障礙及合并Good綜合征等。90例MG患者按照受累肌群分為眼肌組(40例)和全身組(50例)，眼肌組患者男21例、女19例，年齡18～65歲、平均(38.4±6.4)歲，病程3月～4年、平均 (1.4±0.5)年；全身組患者男23例、女27例，年齡18～63歲、平均(40.2±5.9)歲，病程2月～4年、平均(1.4±0.5)年。選取同期醫(yī)院體檢中心40例健康人作為對照組，男21例、女19例，年齡16～62歲、平均(42.1±6.2)歲。3組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究為回顧性研究，經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會審核批準(2017倫審第16號)，所有受試者均口頭同意或簽署書面知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1標本采集 MG患者于免疫治療前采集空腹靜脈血5～10 mL，對照組受試者于健康體檢日抽取空腹靜脈血5～10 mL，2組樣本取3～5 mL加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，置于-80 ℃冰箱保存用于檢測淋巴細胞亞群；剩余樣本于3 500 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱中保存用于檢測血清AchR-Ab。

1.2.2流式細胞法檢測外周血淋巴細胞亞群 取2組受試者全血0.5 mL分別裝100 μL于A～E流式管，分別加標記抗體(美國Becton Dickinson)，其中A管加CD8-APC(CD8-allophycocyanin)、CD45RA-FITC(CD45-fluorescein isothiocyanate)、CD45RO-PE(CD45-P-phycoerythrin)及CD3-PerCP(CD3-peridinin chlorophyll protein)各5 μL，B管加CD4-APC、CD45RA-FITC、CD45RO-PE及CD3-PerCP各5 μL，C管加CD56-APC、CD3-PerCP及CD16-PE均5 μL，D管加CD19-FITC、CD5-APC及CD1d-PE各5 μL，E管為CD4-FITC和CD25-APC各10 μL、CD127-PE 5 μL ，每管分別設置對照，各管混勻后實驗室室溫下避光放置20 min；A～D管及其對照管中各加溶血素2 mL，混勻、避光放置5 min，1 200 r/min離心5 min并取沉淀；沉淀中加2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，1 200 r/min離心5 min并取沉淀，重復操作3次，在最終得到的細胞沉淀加1%甲醇固定，重懸細胞至細胞液達到500 μL，采用CyFlow Robby 6型流式細胞儀(廣州吉源生物有限公司)檢測并能保證每管中至少能獲得3×104個細胞為有效結果，T淋巴細胞亞群和NK細胞檢測結果采用二維點陣圖判斷，分別計算CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+及NK細胞(CD16+CD3-CD56+)所占比例。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測MG患者血清AchR-Ab陽性率 采用ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)對MG患者血清AChR-Ab進行檢測，取出試劑于20 ℃室溫下放置0.5 h，所有樣品和試劑在使用前需短暫離心30 s，分別以1 ∶100和1 ∶25對樣品稀釋液和洗滌液進行稀釋；在酶標板孔中加陰性(100 μL)、陽性對照(100 μL)及稀釋的待測標本(100 μL)，留3個空白對照孔并加樣本稀釋液、混勻，25 ℃恒溫箱中放置1 h，孵育結束后取出，吸去孔板中液體，采用稀釋后的洗滌劑清洗孔板，按300 μL/孔加洗滌劑浸泡清洗3 min，重復洗3次；每個孔板中加入試劑盒中底物A、B，20～25 ℃避光放置0.5 h終止；采用酶標儀測量各孔的光密度(optical density，OD)值(波長為450 nm)，應用Gen5分析軟件分析檢測結果。參照試劑盒說明，以OD≥0.21為AChR-Ab陽性，OD<0.21為AChR-Ab陰性，每個樣本至少檢測3次。

1.2.4MG患者評分[7-9]所有MG患者首次就診時采用重癥肌無力定量評分(quantitative myasthenia gravis score，QMGS)和重癥肌無力絕對和相對評分(absolute and relative score of myasthenia gravis，ARS-MG)對MG病情嚴重程度進行評價，QMG評分按照4個程度分別計0～3分，共13個項目、總分0～39分；ARS-MG評分按照5個程度分別計0～4分，共8個項目、總分0～32分；2組患者評分分值越高，受累肌群越多，肌無力癥狀越重；評分均由主治醫(yī)師進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 T淋巴細胞亞群

結果提示，全身組MG患者外周血CD4+、CD4+/CD8+及NK細胞比例分別高于對照組和眼肌組，但CD8+細胞比例分別低于對照組和眼肌組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；眼肌組MG患者外周血CD4+/CD8+及NK細胞比例高于對照組(P<0.05)，但CD4+、CD8+細胞比例與對照組比較、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試者外周血淋巴細胞亞群水平

2.2 QMG評分和ARS-MG評分

全身組MG患者QMG評分和ARS-MG評分均高于眼肌組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 全身組和眼肌組MG患者QMG和ARS-MG評分

2.3 MG患者外周血淋巴細胞亞群與病情評分的相關性

結果提示，MG患者外周血CD4+、CD4+/CD8+及NK細胞比例分別與QMG、ARS-MG評分呈正相關(P<0.05)，CD8+細胞比例與QMG、ARS-MG評分呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 MG患者血清淋巴細胞亞群與病情評分的相關性

2.4 MG患者血清AChR-Ab水平

全身組MG患者血清AChR-Ab陽性率高于眼肌組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 全身組和眼肌組MG患者血清AChR-Ab表達

2.5 MG患者外周血淋巴細胞亞群與血清AChR-Ab陽性率的相關性

Spearman相關性分析結果表明，MG患者AChR-Ab陽性率分別與外周血CD4+(r=0.721，P<0.001)、CD4+/CD8+(r=0.641，P<0.001)及NK細胞比例(r=0.655，P<0.001)呈正相關，CD8+與AChR-Ab陽性率呈負相關(r=-0.744，P<0.001)。

3 討論

MG是一種自身免疫性的慢性疾病，病情遷延難愈、反復發(fā)作，多數(shù)患者需長期服用免疫抑制類藥物來控制病情，但長期服用免疫抑制藥物可引發(fā)機體免疫功能紊亂以及嚴重不良反應的發(fā)生[10]。因此，需要長期跟蹤隨訪患者，定量評估治療合理性并及時調(diào)整治療方案，從而使患者獲得更好的療效并減少復發(fā)率和不良反應的發(fā)生。MG的發(fā)病機制取決于T細胞、B細胞以及補體和細胞因子，其中抗原特異性T細胞及其功能性亞群的激活是MG發(fā)病的始動環(huán)節(jié)，是產(chǎn)生自身免疫反應的基礎[11]。CD3是T細胞表面的一種分化抗原，由γ、δ、ε、ζ4種成分或γ、δ、ε、ζ、η5種成分的跨膜蛋白組成，表達于成熟T淋巴細胞表面，是總T細胞群的特征性表面標志[12]。CD3分子與T細胞受體(T cell receptor，TCR)組成TCR/CD3復合物，當TCR特異性識別并結合抗原后，CD3分子參與將信號轉導至T細胞胞內(nèi)，作為誘導T細胞活化的第一信號[13]；基于上述機制，抗CD3單克隆抗體被廣泛研究應用于治療各種器官移植后急性排斥反應以及如1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，并取得了一定的療效[14-16]。Kuhn等[17]研究表明，在治療1型糖尿病過程中，CD3特異性抗體可能通過誘導效應T細胞凋亡，恢復效應T細胞與調(diào)節(jié)T細胞的平衡而產(chǎn)生治療作用；但Xu等[18]研究表明，在實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)動物模型中，連續(xù)5 d注射抗CD3單抗后并未能改善小鼠的臨床體征及臨床評分，實驗組小鼠AChR-Ab滴度與對照組亦無明顯差異，猜測CD3特異性抗體不能使MG的致病T細胞產(chǎn)生耐受。由此可見，盡管T細胞在MG發(fā)病機制中有重要作用，但是CD3+T細胞并不能很好地反映MG的病理生理進展狀態(tài)，尤其是在臨床中對于部分使用了如環(huán)胞霉素A、他克莫司等針對T細胞藥物的MG患者。此時，探討CD3+T細胞亞群的改變可能對判定體內(nèi)免疫紊亂及病情嚴重程度更有意義。按照表型的不同，CD3+T細胞可進一步分為CD3+CD4+CD8-和 CD3+CD4-CD8+T細胞，即CD4+T細胞和CD8+T細胞[19]。正常情況下，CD4+T細胞與CD8+T細胞相互拮抗而維持平衡，兩者之間互為協(xié)調(diào)和對立，變化不同步[20]。在自身免疫性疾病中，因自身免疫耐受已被打破，細胞亞群及比值發(fā)生紊亂[21]。因此，通過對CD4+T細胞和CD8+T細胞等亞群的分析可以了解體內(nèi)免疫紊亂的情況。在MG的發(fā)病機制中，各淋巴細胞亞群的激活水平仍不清楚。本研究評估了MG患者T細胞、NK細胞亞群與病情嚴重程度(QMG、ARS-MG)與AChR-Ab陽性率之間的關系，鑒于CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD3+T細胞之間的依存及包含關系，本研究未納入CD3+進行分析。

淋巴細胞作為機體免疫的核心細胞，通過與主要組織相容性復合體遞呈的多態(tài)抗原反應被激活使CD4+T細胞激活分泌細胞因子，輔助T淋巴細胞轉變?yōu)樾毎虰淋巴細胞生成抗體等作用發(fā)揮其細胞免疫及體液免疫作用[22]。CD8+T細胞分為T抑制細胞和細胞毒細胞，具有抑制細胞免疫及體液免疫、殺傷靶細胞的功能[23]。CD4+及CD8+相互誘導、相互制約形成一個復雜的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，一旦失調(diào)會導致自身機體免疫紊亂，因此在免疫應答的調(diào)控及免疫自身穩(wěn)態(tài)等方面具有重要的臨床意義[20]。細胞免疫在MG患者起病和發(fā)病過程中起到重要作用，Homma等[24]研究發(fā)現(xiàn)，通過分離MG患者T淋巴細胞，建立了AChR反應性細胞株，發(fā)現(xiàn)該細胞株表達CD3+CD4+，是Th亞群的代表細胞，說明CD4+T細胞參與了MG致病性抗體產(chǎn)生。而在Yan等[25]動物實驗中，EAMG模型中CD4-CD8-和CD4+CD8+均處于被抑制狀態(tài)。以上結果提示淋巴細胞在MG的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究得出，MG患者CD4+、CD4+/CD8+均高于對照組，CD8+低于對照組，再次證明MG患者中存在免疫調(diào)節(jié)紊亂和失衡，免疫平衡紊亂可能與MG發(fā)病有關；MG患者CD4+、CD4+/CD8+、CD8+細胞具有差異，提示CD4+升高、CD8+降低可能是全身型MG患者致病的原因之一，且可能與眼肌型向全身型進展密切相關。因此，淋巴細胞可以作為臨床上評估病情嚴重程度的客觀指標。

NK細胞是一種異質(zhì)性多功能免疫細胞，受白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)及干擾素等因子的調(diào)控，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，參與了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，現(xiàn)認為NK細胞數(shù)量減少和功能缺陷是導致MG患者機體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂的重要原因之一[26]。NK細胞具有獨立生物活性，是細胞免疫的代表，可對腫瘤和病毒感染細胞進行直接殺傷作用[5]。NK細胞在白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)培養(yǎng)條件下可分泌白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，而淋巴細胞輔助性T(T helper cell，Th1)細胞中也主要分泌IFN-γ，因此認為NK細胞與具有相似功能，IFN-γ可增加主要組織相容性復合體II(major histocompatibility complex，MHC II)類分子的表達，可誘導B細胞成熟，輔助產(chǎn)生AChR-Ab，誘導MG的產(chǎn)生[27]。研究發(fā)現(xiàn)在EAMG小鼠體內(nèi)，NK細胞能激活機體CD4+T細胞來輔助活化后的B淋巴細胞分泌AChR-Ab[5]；葛夢茹[26]研究發(fā)現(xiàn)，病情加重的MG患者中CXCR5+NK細胞比例較對照組顯著增高，病情緩解的MG患者中CXCR5+NK細胞比例卻較加重組有明顯下降趨勢。本研究結果得出實驗組NK細胞較對照組升高，與文獻報道一致。因此，NK細胞可能與MG的病情密切相關，其有可能成為衡量MG癥狀嚴重程度的一個潛在指標，但具體的發(fā)病機制需進一步深入研究。

MG的臨床表現(xiàn)可為全身多組肌群均可受累，1958年Osserman首次提出重癥肌無力分型，在臨床上得到廣泛的應用，但缺乏客觀判斷指標，不利于臨床觀察與比較。因此，2000年MGFA提出新的臨床分型及QMG評分，對MG患者受累肌群肌無力嚴重程度具有客觀的評價，不同MGFA分型的MG患者治療前后采用QMG評分進行病情評估具有較高敏感性，更能客觀、細致地反映出病人病情以及治療前后的變化與波動，有利于進行預后分析與療效判斷[28]。QMG評分和ARS-MG評分是臨床上常用對MG患者病情嚴重程度進行評估的客觀量化指標，在近年來的研究中已經(jīng)得到廣泛應用，評估指標可靠[9]。就患者淋巴細胞亞群與QMG評分和ARS-MG評分進行Pearson相關性分析，結果表明CD4+、CD4+/CD8+、NK細胞與QMG評分和ARS-MG評分呈正相關，CD8+與QMG評分和ARS-MG評分呈負相關，提示CD4+、CD4+/CD8+、NK升高，而CD8+降低，MG病情更嚴重。臨床上可通過淋巴細胞亞群的數(shù)值對MG患者進行病情評估。

在以往研究中，AChR-Ab陽性率與MG患者病情嚴重程度無相關性，僅在臨床分型上有一定差異，袁東風等[29]研究中全身型MG患者AChR-Ab陽性率達85%以上，眼肌型MG患者介于60%～85%。本研究結果顯示，全身組MG患者AChR-Ab陽性率高于眼肌組，與以往研究結果一致。另外，本研究通過Spearman相關性分析，發(fā)現(xiàn)CD4+、CD4+/CD8+、NK細胞與AChR-Ab呈正相關，CD8+與AChR-Ab呈負相關，提示CD4+、CD4+/CD8+、NK升高，而CD8+降低，MG患者的病情相對較重，AChR-Ab更傾向于陽性，其具體發(fā)生機制有待進一步研究。 因此，淋巴細胞亞群水平可能作為評價MG患者病情嚴重程度和AChR-Ab陽性率的重要參考指標，并指導臨床診療方案。