陳天鳴， 潘耀振

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 貴州省腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的肝惡性腫瘤之一，高度惡性、預(yù)后較差。合適的肝腫瘤動(dòng)物模型對(duì)于肝癌診斷和各種治療方法的研究很重要。兔VX2肝腫瘤生長(zhǎng)迅速，其動(dòng)脈血供與人類肝癌相似，且腫瘤大小足以通過臨床影像觀察到[1]，因此，兔VX2肝腫瘤模型已廣泛用于肝腫瘤研究的各個(gè)方面。動(dòng)物模型成功建立取決于在兔肝中有效接種VX2并生長(zhǎng)形成腫瘤，因此在某種程度上，腫瘤接種技術(shù)的改進(jìn)必定會(huì)對(duì)HCC的進(jìn)一步研究提供幫助。以往研究中有通過剖腹術(shù)、超聲或計(jì)算機(jī)體層成像(computerized tomography, CT)引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺植入腫瘤細(xì)胞懸液和腫瘤碎片等方法進(jìn)行兔肝臟VX2腫瘤的復(fù)制，但是都有缺陷[2]，常會(huì)出現(xiàn)移植瘤處肝表面及臨近腹壁發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3]。本探究對(duì)兔VX2肝癌模型的制作方法進(jìn)行了改良，并就其影像學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性實(shí)驗(yàn)用新西蘭白兔，約3～4月，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要儀器與試劑 4F血管鞘及穿刺針、2.7F同軸微導(dǎo)管購(gòu)于日本Terumo公司，外科手術(shù)器械盒、陸眠寧Ⅱ由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供， GE signa ExciteⅡ1.5T超導(dǎo)型磁共振成像儀、AW4.1工作站購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司，64排螺旋CT購(gòu)于荷蘭Philips公司，釓噴酸葡胺注射液、碘海醇購(gòu)于中國(guó)上海GE醫(yī)療公司，HE染色試劑盒購(gòu)于廣州晶欣生物科技有限公司，CD31抗體、免疫組化試劑盒購(gòu)于丹麥Dako公司。

1.2 方法

1.2.1VX2腫瘤組織制備 隨機(jī)選擇2只兔在麻醉狀態(tài)下，將VX2細(xì)胞懸液0.2 mL注射到兔雙后肢外側(cè)肌肉中；植入3周后，腫瘤增長(zhǎng)到直徑約3 cm，對(duì)兔子實(shí)施安樂死，在無菌條件下暴露并剝離位于后肢外側(cè)深部肌肉內(nèi)的VX2腫瘤組織，仔細(xì)剔除腫瘤組織周圍的肌肉、血管及筋膜組織，用0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗腫瘤中心壞死組織，留取瘤塊周圍生長(zhǎng)旺盛半透明魚肉樣、富有彈性的、活性較高的VX2腫瘤組織，將腫瘤組織剪成大小約1 mm3的瘤塊碎片，進(jìn)行接種。

1.2.2肝臟VX2腫瘤模型的建立 待接種的實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前常規(guī)禁飲食8 h，提前做好中上腹部脫毛、備皮準(zhǔn)備；待麻醉起效后，將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定于操作臺(tái)，嚴(yán)格按照外科無菌操作步驟常規(guī)消毒術(shù)區(qū)皮膚，在CT引導(dǎo)下利用3D打印模板上孔洞進(jìn)行經(jīng)皮肝穿刺，將16G的針刺入16只健康兔肝左葉實(shí)質(zhì)中，并注入0.2 mL碘海醇確認(rèn)針尖避開了肝內(nèi)血管與膽管；植入1 mm3VX2腫瘤組織，在確認(rèn)無誤后用注入纖維蛋白膠1 mL，封堵穿刺通道以固定VX2腫瘤片段，拔出針頭用明膠海綿輕輕按壓穿刺處3 min，以防VX2腫瘤外溢及穿刺通道的出血。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素40萬(wàn)單位肌肉注射。

1.2.3CT與MRI檢測(cè) 分別在影像檢查前禁食12 h和禁水6 h，CT采用平掃與增強(qiáng)掃描結(jié)合，觀察腫瘤種植情況及大小。先平掃定位，后序貫動(dòng)態(tài)三期增強(qiáng)掃描，采集時(shí)間分別為動(dòng)脈期(15 s)、靜脈期(25 s)和延遲期(45 s)。造影劑選用碘海醇，采用高壓注射器設(shè)定0.5 L/s的速率注射純?cè)煊皠? mL。設(shè)置掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流106 mA。MRI采用平掃與增強(qiáng)掃描結(jié)合，在植入后第14天所有模型兔應(yīng)用帶有單獨(dú)的與SENSE兼容的體部相控陣線圈(人類膝蓋線圈，上海晨光醫(yī)療技術(shù)有限公司)，共由8個(gè)單元組成在配有SENSE軟件的Ingenia3.0T數(shù)字化MR掃描機(jī)上進(jìn)行DWI(軸向)和MRI(T1WI和T2WI，軸向)檢測(cè)，使用毛巾包裹模型兔的腹部，以減少呼吸運(yùn)動(dòng)偽影。所有的檢查都以相同的參數(shù)進(jìn)行，方案如下：T2-TSE成像參數(shù)[重復(fù)時(shí)間(time of repetition, TR) 1 129 ms, 回波時(shí)間(time of echo, TE) 80 ms，時(shí)間(time, T)17 s，重建體素(reconstruction voxel, REC voxel) 0.78/0.78/4.00 mm，翻轉(zhuǎn)角(flip angle, FA) 125 deg，視野(field of view, FOV) 400 mm×330 mm；層數(shù)，軸位15層，層厚(slice thickness, ST) 4.0 mm，層間距(slice gap, SG) 0 mm，信號(hào)平均次數(shù)(number of signal averaged, NSA) 1]、T1-TFE成像參數(shù)[TR/TE為10/2.3，T為14 s，REC Voxel為0.93/0.93/4.00 mm，F(xiàn)A為15 deg，F(xiàn)OV為400 mm×330 mm；層數(shù)，軸位15層，ST為4.0 mm，SG為0 mm，NSA為1]、DWI的參數(shù)[TR/TE為749/70, T為36 s，REC Voxel為1.25/125/4.00 mm,FA為90 deg，F(xiàn)OV為400 mm ×330 mm；層數(shù)，軸位15層，ST為4.0 mm,SG為0 mm,NSA為1]。在完成T1、T2前5次基線測(cè)量后，使用自動(dòng)注射器(Mallinckrodt，C1213D005X1ml)以馬根維顯1 mL即釓噴酸葡胺(Gd-DTPA約0.2 mmol / kg體質(zhì)量)通過左右耳靜脈以2 mL/ s的劑量推注，進(jìn)行DCE-MRI，在靜脈注射造影劑(contrast agent，CA)之前和之后依次采集組織的磁共振圖像進(jìn)行DCE-MRI圖像分析。將獲得的DCE-MRI圖像發(fā)送到Tissue-4D工作站(Toft模型)，從而導(dǎo)出以下參數(shù)：(1)體積轉(zhuǎn)移常數(shù)K(K volume transfer constant, Ktrans)為造影劑從血管內(nèi)到血管與細(xì)胞之間間隙(extravascular extracellular space，EES)的傳輸速率；(2)回流速率常數(shù)(return rate constant, Kep)為造影劑從EES到血管內(nèi)腔的的體積；(3)容積分?jǐn)?shù)(fraction by volume, Ve)為間接代表組織中細(xì)胞密度，Ve=Ktrans/Kep；(4)初始1 min釓濃度時(shí)間曲線下面積(area under curve/initial area under the contrast concentration versus time curve，iAUC60)表示造影劑的劑量從注射點(diǎn)到60 s時(shí)的時(shí)間強(qiáng)度曲線(time intensity curve，TIC)，由腫瘤血液供應(yīng)和內(nèi)皮通透性決定的最常用的半定量參數(shù)。在灌注成像上選擇腫瘤的最大掃描層面或兩個(gè)最大相鄰層面通過軟件獲取參數(shù)Ktrans、Kep、Ve和iAUC60值。

1.2.4組織觀察 在完成CT、MRI檢查之后，每只模型兔予以安樂死，然后取出肝臟標(biāo)本確定肝臟中的腫瘤生長(zhǎng)情況，使用蘇木精-伊紅(HE)染色收集所有肝臟腫瘤進(jìn)行病理檢查。

1.2.5微血管密度(microvessel density，MVD)檢測(cè) 使用針對(duì)CD31的單克隆抗體的常規(guī)免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，癌細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)有孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞簇或血管腔面積<8個(gè)紅細(xì)胞，且管壁無肌層代表1條單獨(dú)的微血管。先在低倍鏡下找腫瘤組織內(nèi)MVD最高區(qū)域，然后在200倍視野下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，再將總數(shù)除以3，取其平均值作為腫瘤該視野下的MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟VX2腫瘤模型的建立

從2只兔后肢接種VX2腫瘤細(xì)胞處獲取VX2腫瘤組織，接種于剩余16只兔的肝臟中，肝臟移植瘤種植術(shù)后動(dòng)物進(jìn)食量減少、飲水量增多，2～3 d后逐漸恢復(fù)術(shù)前飲食狀況，活動(dòng)及二便基本正常；在植入過程中未觀察到動(dòng)物死亡和感染。

2.2 CT檢查

于種植術(shù)后第14天行肝癌CT平掃，16只兔均接種成功，腫瘤均位于肝左外葉，且每只兔均只有一個(gè)病灶；接種后第14天，腫瘤平均大小為1.9 cm×1.1 cm，表現(xiàn)為低或等密度結(jié)節(jié)或腫塊影，與周圍正常肝實(shí)質(zhì)邊緣欠清(圖1)；增強(qiáng)掃描，動(dòng)脈期腫瘤明顯強(qiáng)化呈環(huán)形高密度影，門脈期腫瘤密度降低至等密度，邊緣及正常的肝實(shí)質(zhì)增強(qiáng)，靜脈期表現(xiàn)為腫瘤密度低于正常肝實(shí)質(zhì)(圖2)。

注:A為左肝低密度腫塊，B和C為等密度腫塊。

注:A為動(dòng)脈期，B為門脈期，C為靜脈期。

2.3 MRI檢查

種植術(shù)后第14天行肝癌MRI檢查，結(jié)果顯示兔肝左葉腫瘤在T1W圖像為低信號(hào)，T2W圖像和DW圖像為高信號(hào)。增強(qiáng)MRI顯示兔肝左葉腫瘤呈邊緣環(huán)狀強(qiáng)化影，可在靜脈注射造影劑之前和之后依次采集組織的磁共振圖像進(jìn)行DCE-MRI圖像分析，獲取參數(shù)Ktrans、Kep、Ve和iAUC60值。見圖3和圖4。

注:A為軸向T1W圖，B為軸向T2W圖，C為DW圖(b為800 s/mm2)，D為冠向T2W圖。

注：A為腫瘤軸向T1W圖，B為軸向T2W圖，C為冠向T2W圖，D為軸向DW圖(b為800 s/mm2)。

2.4 腫瘤組織觀察

肉眼可見肝內(nèi)直徑約1.5 cm的灰白色、魚肉樣結(jié)節(jié)，與正常肝組織分界清楚，呈圓形、質(zhì)硬(圖5)。HE染色：腫瘤組織中毛細(xì)血管多，結(jié)締組織少；腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣、體積大、排列不規(guī)則，呈巢狀分布；細(xì)胞核明顯不均一、胞核大且深染，提示肝內(nèi)VX2腫瘤接種成功(圖6～8)。

注:A為肝臟及移植瘤，B為肝臟移植瘤。

注：A為200×，B為400×。

2.5 MVD

顯微鏡觀察結(jié)果顯示，兔腫瘤組織中染成棕色具有管腔的內(nèi)皮細(xì)胞簇形成微血管或不具有管腔的內(nèi)皮細(xì)胞簇的內(nèi)皮細(xì)胞，見圖7。16只兔子肝VX2腫瘤中平均MVD為(23.858±2.115)個(gè)/視野。

注：A箭頭處為微血管管腔(100×)，B箭頭處為內(nèi)皮細(xì)胞簇(400×)。

2.6 Ktrans、Kep、Ve、 iAUC60與MVD的相關(guān)性

Ktrans和iAUC60與MVD正相關(guān)(Ktrans：r=0.545，P=0.029； iAUC60：r=0.553，P=0.026)，而Kep和Ve與MVD不相關(guān)(Kep：r=0.048，P=0.059；Ve：r=0.297，P=0.265)。見表1和圖8。

表1 兔腫瘤組織Ktrans、Kep、Ve、iAUC60及MVD

注：A為Ktrans與MVD的相關(guān)性，B為Kep與MVD的相關(guān)性，C為Ve與MVD的相關(guān)性，D為 iAUC60與MVD的相關(guān)性。

3 討論

本研究通過3D打印模板改進(jìn)CT引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺將活性VX2腫瘤組織碎片植入家兔的肝臟，接種2周后行CT、MRI檢測(cè)及肝組織病理檢查驗(yàn)證模型建立情況，結(jié)果顯示16只兔肝臟內(nèi)均成功接種VX2腫瘤，兔成瘤位置精準(zhǔn)，成功率100%。穿刺靶點(diǎn)設(shè)在左葉中部位置，并注入碘海醇0.2 mL確認(rèn)針尖避開膽管和血管系統(tǒng)，無大血管損傷及膽瘺發(fā)生。植入腫瘤后再用纖維蛋白膠1 mL注入封堵針道，以防VX2腫瘤外溢及誤入肝竇與肝內(nèi)小血管中，拔出針頭用明膠海綿輕輕按壓穿刺處3 min，以避免異位種植發(fā)生。均該模型成功建立可以為肝癌的影像學(xué)診斷和治療研究提供很好的平臺(tái)。

兔肝癌接種模型較多，從接種途徑角度可分為開腹直接接種法與影像引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺接種法，前者因創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多以及易種植轉(zhuǎn)移而逐漸被后者取代[2,4]。目前影像引導(dǎo)主要有CT與超聲兩種手段[5]。本研究結(jié)果表明，CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺將活性VX2腫瘤組織碎片植入家兔肝臟并用纖維蛋白膠注入封堵針道方法優(yōu)點(diǎn)有：精準(zhǔn)引導(dǎo)、簡(jiǎn)單易行，可減少對(duì)肝臟的傷害，縮短手術(shù)時(shí)間，降低死亡率及開腹與常規(guī)影像引導(dǎo)的穿刺并發(fā)癥，減少腹腔種植、腹壁浸潤(rùn)，從而大大提高模型建立的成功率。但此操作也存在不便之處，如CT無法實(shí)施超聲引導(dǎo)下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)進(jìn)針路徑、實(shí)時(shí)調(diào)整針尖位置功能，也無法提供彩超操作的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像，相比之下，操作更為復(fù)雜[6]。本研究所得數(shù)據(jù)結(jié)果表明該改進(jìn)對(duì)更精準(zhǔn)的構(gòu)建兔VX2肝腫瘤模型有利，具有一定推廣意義。如在本研究基礎(chǔ)上與超聲引導(dǎo)進(jìn)行前瞻性對(duì)比研究，或許能進(jìn)一步改良兔VX2肝腫瘤模型的建立方法，對(duì)肝細(xì)胞癌研究的意義深遠(yuǎn)。兔VX2肝癌通常在VX2腫瘤組織植入后第14天表現(xiàn)出最佳的腫瘤生存力，而沒有明顯的壞死。因此，本研究中的所有模型兔均在手術(shù)后第14天進(jìn)行MRI檢測(cè)，以確保肝臟中腫瘤結(jié)節(jié)的形成。

CT增強(qiáng)是用于檢查肝占位的一種有效手段，接種后2周左右時(shí)可見邊界清楚的低密度結(jié)節(jié)，增強(qiáng)造影可觀察到動(dòng)脈早期明顯強(qiáng)化，門靜脈期呈較低密度與周圍肝組織分界較清楚，3周以上瘤灶大多出現(xiàn)明顯壞死。本研究也發(fā)現(xiàn)所有VX2腫瘤2周左右時(shí)均表現(xiàn)出相同的增強(qiáng)模式：首先顯示出腫瘤外圍區(qū)域的增強(qiáng)，并且由于壞死而觀察到弱的腫瘤內(nèi)增強(qiáng)。盡管如此，對(duì)于小肝癌的診斷MR成像明顯優(yōu)于CT[7]，在進(jìn)行多序列、多方位、多角度顯示時(shí)，CT增強(qiáng)檢測(cè)不如MRI增強(qiáng)靈敏、精準(zhǔn)、全面。本研究結(jié)果還顯示肝癌在核磁T1加權(quán)上顯示低信號(hào)，T2加權(quán)稍高信號(hào)，增強(qiáng)后瘤灶呈邊緣環(huán)狀強(qiáng)化。

近年來灌注成像以評(píng)估腫瘤血管生成的非侵入性和可重復(fù)性成像方法已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，DCE-MRI作為一種灌注成像，可用于評(píng)估射頻、微波、冷凍等各種局部腫瘤消融及抗血管生成藥物和血管破壞療法的療效[8-9]，可惜的是目前有關(guān)兔VX2動(dòng)物模型中對(duì)DCE-MRI參數(shù)和MVD之間關(guān)系研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示采用DCE-MRI灌注成像技術(shù)可大大提高1cm左右瘤灶的檢出率，DCE-MRI的參數(shù)(Ktransand iAUC60)和MVD之間的顯著相關(guān)，與既往的研究結(jié)果相似[10]。DCE-MRI參數(shù)可以提供有關(guān)血管血液灌注和血管通透性的功能性信息，這些信息廣泛用于評(píng)估肝腫瘤患者抗血管治療，并作為影像學(xué)生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)治療效果和生存率[11-12]。眾所周知，腫瘤血管生成的主要介質(zhì)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，VEGF和MVD表達(dá)之間呈正相關(guān)[13-14]，因此，病理學(xué)家通常使用MVD計(jì)數(shù)來說明微環(huán)境的變化，而MVD表達(dá)以CD31的表達(dá)來顯示[15]。但應(yīng)用病理上MVD計(jì)數(shù)方法在臨床及諸多實(shí)驗(yàn)中無法應(yīng)用，因此人們一直在尋求通過無創(chuàng)的成像技術(shù)檢測(cè)微環(huán)境的變化。已證明MRI是一種用于獲取有關(guān)腫瘤微脈管系統(tǒng)信息的非侵入性和非電離方法，它提供了多種獲取血管信息的方法，MRI方法包括動(dòng)脈自旋標(biāo)記，動(dòng)態(tài)磁化率對(duì)比MRI，血液氧合水平依賴性成像和DCE-MRI[16-17]，其中，DCE-MRI是一種提供血管信息的體內(nèi)成像方法，已成為臨床前和臨床研究的重要工具[11,18]?；贑A的首過效應(yīng)在T2加權(quán)DCE-MRI效果是瞬間的，因此獲取的圖像單一，這在肝臟研究中價(jià)值有限；相比之下，T1加權(quán)DCE-MRI通常能在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)測(cè)量組織中CA的積累，可以依時(shí)間變化采集組織上T1加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度的演化曲線，因此，T1加權(quán)DCE-MRI技術(shù)更常用于肝癌研究。

Tissue-4D軟件基于Toft的單輸入兩室藥代動(dòng)力學(xué)模型，該模型描述了造影劑在血漿和血管外細(xì)胞外區(qū)室之間的運(yùn)輸，并估計(jì)了血漿和EES之間的Ktrans，EES和血漿之間的Kep以及EES的Ve。同時(shí)計(jì)算出來自濃度-時(shí)間曲線的半定量參數(shù)iAUC60，對(duì)血管生成及微循環(huán)中血流狀況進(jìn)行簡(jiǎn)單而可靠的估計(jì)，并可較容易地進(jìn)行比較研究[19]。本研究之所以選擇該模型，是因?yàn)閂X2肝腫瘤從肝動(dòng)脈獲得大量血液供應(yīng)，并且血液分布在血漿和EES兩個(gè)腔室中。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Ktransand iAUC60有望以無創(chuàng)方式評(píng)估腫瘤血管生成，但這一結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。(1)MVD測(cè)量是一種定量的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，受ROI的限制，不能反映組織微脈管系統(tǒng)的所有功能特性，包括DCE-MRI測(cè)量的通透性。(2)DCE-MRI中分析的參數(shù)與MVD計(jì)數(shù)之間的成像和病理學(xué)不完全匹配。(3)在有限數(shù)量的動(dòng)物模型中存在潛在的偏倚，病理與MRI表現(xiàn)之間的相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。(4)動(dòng)脈輸入功能的參數(shù)是為人體設(shè)計(jì)的Tissue-4D軟件(SIEMENS)的內(nèi)置數(shù)據(jù)，因此當(dāng)使用它來評(píng)估實(shí)驗(yàn)兔的數(shù)據(jù)時(shí)仍然存在系統(tǒng)錯(cuò)誤。

總之，簡(jiǎn)單而有效的用纖維蛋白膠通過16G鞘管針將腫瘤碎片置入肝臟，顯著提高了建模的成功率，并有效減少了并發(fā)癥的產(chǎn)生，使腫瘤細(xì)胞植入后的肝內(nèi)種植轉(zhuǎn)移概率顯著下降，這可能是誘導(dǎo)肝腫瘤的一種有應(yīng)用前景的有效方法。如此獲得的較為理想肝臟VX2腫瘤模型，可通過CT及MRI增強(qiáng)實(shí)時(shí)且準(zhǔn)確地評(píng)估腫瘤的血管生成和血流灌注，為諸如敏感藥物篩選、藥物有效性和毒副作用研究、外科消融、外科手術(shù)以及相關(guān)腫瘤微環(huán)境等相關(guān)研究提供平臺(tái)，對(duì)肝癌動(dòng)物水平上的研究有著重要意義，并對(duì)進(jìn)一步研究提供了新的思路。