伍玉海， 戴大飛， 葉蕊， 于北北， 張書軍， 陳曉鵬***

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生院， 安徽 蕪湖 241002； 2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院 肝膽一科， 安徽 蕪湖 241001)

目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在對(duì)疾病的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其中包括環(huán)狀RNA( circular RNA，circRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)[1]。circRNA是通過(guò)部分基因外顯子環(huán)化而成的，由于沒(méi)有3′-尾巴和5′-帽子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而避免了RNA酶消化，可穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)[2]，因此circRNA可被用作腫瘤的診斷探針[3]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA可通過(guò)靶向吸附miRNA來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，在癌癥有關(guān)的各種生物學(xué)過(guò)程中充當(dāng)重要調(diào)節(jié)劑，包括細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響疾病進(jìn)程[4-6]。本研究circRNA名為hsa_circ_0017639(Geo數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE78092)，hsa_circ_0017639源自基因SFMBT2(scm-like with four mbt domains 2)，因此被命名為circ-SFMBT2。既往研究發(fā)現(xiàn)circ-SFMBT2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，沉默circ-SFMBT2會(huì)顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖[7]，circ-SFMBT2通過(guò)mirR-182-5p/MTSS1途徑抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8]，circ-SFMBT2在眾多circRNA中屬于一個(gè)研究較新的基因，在其他腫瘤等疾病中的作用及機(jī)制尚不明確。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第5大常見(jiàn)的癌癥[9]，circ-SFMBT2在肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中具有研究?jī)r(jià)值。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞高表達(dá)circ-SFMBT2，并進(jìn)一步探究其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響以及可能的調(diào)控機(jī)制，為肝癌治療提供潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、Huh-7、Sk-Hep-1及人正常肝細(xì)胞細(xì)胞系LO2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清、氨基酸葡萄糖培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑及OptiMEM低血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，circ-SFMBT2干擾載體和泛素特異性蛋白酶3(Ubiquitin-specific protease 3，USP3)表達(dá)載體(上海吉瑪基因生物)，RNA TRIzol提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen)，pTRUEscript the First Strand cDNA Synthesis Kit和2×SYBR Green qPCR Mix(北京Aidlab)，細(xì)胞增殖檢測(cè)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(上海碧云天)，Transwell小室(美國(guó)Corning)，Cy5-標(biāo)記的circ-SFMBT2探針(上海生工合成)，qRT-PCR儀(瑞士Roche)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、Huh-7、Sk-Hep-1及人正常肝細(xì)胞LO2置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將circ-SFMBT2干擾載體、circ-SFMBT2 NC載體、miR-224-5p抑制劑、USP3過(guò)表達(dá)載體及miR-224-5p模擬物按照Lipo-2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后分別構(gòu)建circ-SFMBT2干擾組(si-circ-SFMBT2組)、對(duì)照組(circ-SFMBT2 NC，NC組)，在si-circ-SFMBT2干擾組的成功模型后繼續(xù)轉(zhuǎn)染miR-224-5p抑制劑構(gòu)建miR-224-5p抑制組(si-circ-SFMBT2+inhibitor組)、在si-circ-SFMBT2干擾組的成功模型后繼續(xù)轉(zhuǎn)染USP3過(guò)表達(dá)構(gòu)建USP3過(guò)表達(dá)組(si-circ-SFMBT2+USP3組)，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-224-5p過(guò)表達(dá)模擬物成功構(gòu)建miR-224-5p mimic組(mimic組)，在miR-224-5p mimic組成功模型后繼續(xù)轉(zhuǎn)染USP3過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 mimic+USP3組。具體方法是將轉(zhuǎn)染片段(50 ng)與Lipo2000混合后加OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，換正常DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h，細(xì)胞經(jīng)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR 細(xì)胞總RNA利用TRIzol試劑進(jìn)行抽提，利用pTRUEscript the First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)合成，利用2×SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)；利用2-ΔΔCt計(jì)算方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物見(jiàn)表1。

表1 目的基因及陰性對(duì)照基因引物序列

1.2.3生物信息學(xué)分析 circRNA和miRNA之間的靶向作用關(guān)系通過(guò)Circular RNA Interactome網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，miRNAs和信使RNA(messger RNAs，mRNAs)之間的靶向作用關(guān)系利用TargetScan (http://www.targetscan.org/) 網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4熒光原位雜交技術(shù)和雙熒光素實(shí)驗(yàn) 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)分析Cy5-標(biāo)記的circ-SFMBT2探針(5′-CTCCTGCGTCGGTGACTAAGCAATCAAAGAGAAGTAC-3′-biotin)由上海生工合成，細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色。人正常肝細(xì)胞細(xì)胞系LO2標(biāo)記為Normal組，肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株標(biāo)記為HCC組。該實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書要求做，觀察并記錄熒光結(jié)果。

1.2.5CCK-8 取“1.2.1”項(xiàng)下6組HepG2細(xì)胞利用CCK-8試劑盒進(jìn)行增殖檢測(cè)。含有2 000細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基100 μL加96孔板，培養(yǎng)0、24、48及72 h，吸棄培養(yǎng)基，分別替換成含有10%CCK-8試劑的DMEM培養(yǎng)基孵育1 h，酶標(biāo)儀上于 450 nm下測(cè)定各組HepG2細(xì)胞吸光值(optical density，OD)。

1.2.6克隆斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn) 取“1.2.1”項(xiàng)下6組HepG2細(xì)胞按200個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于6孔板，培養(yǎng)10 d，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，拍照統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7細(xì)胞遷移分析 Transwell上室種無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL，其中分別含“1.2.1”項(xiàng)下6組HepG2細(xì)胞1×105個(gè)，下室加含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，置于37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，拍照統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 circ-SFMBT2的表達(dá)

結(jié)果顯示，與LO2細(xì)胞比較，Huh-7、Sk-Hep-1、SMMC7721及HepG2細(xì)胞中circ-SFMBT2表達(dá)均上調(diào)，其中HepG2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)最為明顯(P<0.05)，因此選擇HepG2細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象。見(jiàn)圖1。

注：(1)與LO2比較，P<0.05。

2.2 circ-SFMBT2表達(dá)和亞細(xì)胞定位檢測(cè)

結(jié)果表明，HCC組細(xì)胞circ-SFMBT2表達(dá)較Normal組上調(diào)，且circ-SFMBT2主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。見(jiàn)圖2。

Normal組 HCC組

2.3 干擾circ-SFMBT2表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與NC組比較，si-circ-SFMBT2組 HepG2細(xì)胞 circ-SFMBT2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染circ-SFMBT2干擾載體后，CCK-8和克隆斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細(xì)胞遷移能力降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A為轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞circ-SFMBT2的表達(dá)，B為CCK-8的結(jié)果，C～E分別為 NC組和si-circ-SFMBT2組細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)和定量結(jié)果，F(xiàn)～H分別為Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力形態(tài)學(xué)和定量結(jié)果；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.4 雙熒光素實(shí)驗(yàn)

野生型circ-SFMBT2載體上熒光活力檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-224-5p過(guò)表達(dá)mimic片段的293T細(xì)胞相較于轉(zhuǎn)染miR-224-5p NC片段的293T細(xì)胞熒光活力下降(P<0.05)；USP3-3′UTR野生型熒光素報(bào)告載體上，轉(zhuǎn)染miR-224-5p過(guò)表達(dá)mimic片段的293T細(xì)胞相較于轉(zhuǎn)染miR-224-5p NC片段的293T細(xì)胞熒光活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為circ-SFMBT2熒光載體序列和miR-224-5p轉(zhuǎn)染片段序列，B為circ-SFMBT2載體上雙熒光實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果，C為USP3-3′UTR熒光載體序列和miR-224-5p轉(zhuǎn)染片段序列，D為USP3-3′UTR載體上雙熒光實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果；(1)與miR-NC組比較，P<0.05。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，circ-SFMBT2干擾組(si-circ-SFMBT2組)、miR-224-5p干擾組(si-circ-SFMBT2+inhibitor組)及USP3過(guò)表達(dá)組(si-circ-SFMBT2+USP3組)HepG2細(xì)胞circ-SFMBT2的表達(dá)均較NC組下調(diào)(P<0.05)；與NC組比較，miR-224-5p干擾組HepG2細(xì)胞的miR-224-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，circ-SFMBT2干擾組和USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞的miR-224-5p表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與NC組、circ-SFMBT2干擾組及miR-224-5p干擾組比較，USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞的USP3表達(dá)上調(diào)(P<0.05)?？寺“唿c(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細(xì)胞克隆數(shù)量下降、USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞克隆數(shù)量上升(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量下降(P<0.05)，USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量上升(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A～C分別為轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞circ-SFMBT2、miR-224-5p及USP3的表達(dá)，D～H分別為細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)和定量的結(jié)果，I～M分別為Transwell細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)和定量結(jié)果；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與si-circ-SFMBT2組比較，P<0.05。

2.6 克隆斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較、轉(zhuǎn)染miR-224-5p過(guò)表達(dá)模擬物(mimic)后HepG2細(xì)胞miR-224-5p表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)miR-224-5p過(guò)表達(dá)組和USP3過(guò)表達(dá)組相較于mimic組HepG2細(xì)胞miR-224-5p表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與NC組比較，USP3表達(dá)在mimic組HepG2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞中上調(diào)(P<0.05)。克隆斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，與NC組比較，mimic組HepG2細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)下降、USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)上升(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果表明，與NC組比較，mimic組HepG2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)下降、USP3過(guò)表達(dá)組HepG2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)上升(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注：A、B分別為轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞miR-224-5p和USP3的表達(dá)；C、D、E及F為細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)和定量的結(jié)果，G、H、I及J分別為Transwell細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)和定量結(jié)果；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與mimic組比較，P<0.05。

3 討論

越來(lái)越多的研究表明，circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控系統(tǒng)在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌及肝癌等多種癌癥的進(jìn)展中起著重要的調(diào)控作用，均被證實(shí)可促進(jìn)增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[10-13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，circRNA ABCB10通過(guò)吸附miR-670-3p來(lái)促進(jìn)HMG20A表達(dá)[14]，circ-FOXP1可通過(guò)吸附miR-875-3p來(lái)促進(jìn)SOX9基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)生[15]。circ-SFMBT2吸附miR-182-5p，通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1)mRNA表達(dá)，從而參與胃癌進(jìn)展[7]。本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-SFMBT2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)也顯著升高，為進(jìn)一步探究其在肝癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用，通過(guò)將circ-SFMBT2干擾載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率滿意，順利構(gòu)建si-circ-SFMBT2干擾模型，CCK-8和遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)circ-SFMBT2后抑制了肝癌細(xì)胞增殖和遷移。競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)假說(shuō)認(rèn)為，circRNAs主要是由外顯子組成，并分布于細(xì)胞質(zhì)中，這與circ-SFMBT2的FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，circRNAs能夠通過(guò)與AGO2蛋白結(jié)合，利用自身含有的miRNA反應(yīng)元件(microRNA response element， MRE)吸附下游miRNAs來(lái)調(diào)控基因表達(dá)[16]。此外，最近有研究指出circRNAs可以受到m6A甲基化修飾，這也將為circRNAs的機(jī)制研究打開(kāi)新的篇章[17]。上述這些特征表明 circRNAs具有成為疾病診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circ-SFMBT2下游結(jié)合靶點(diǎn)有很多，包括hsa-miR-1290、miR-1296、miR-1305、miR-182、miR-188-3p、miR-198、miR-224-5p、miR-582-3p、miR-587、miR-622、miR-626及miR-885-3p等，但miR-224-5p與circ-SFMBT2之間在結(jié)合位點(diǎn)上具有更高的保守性，為了進(jìn)一步確定circ-SFMBT2、miR-224-5p之間的靶向作用關(guān)系，將含有miR-224-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ-SFMBT2野生型和突變體序列構(gòu)建到了熒光素報(bào)告載體上，和miR-224-5p過(guò)表達(dá)mimic的片段一起轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型circ-SFMBT2和miR-224-5p mimic的熒光活力降低，說(shuō)明circ-SFMBT2和miR-224-5p之間存在靶向作用關(guān)系。先前的研究表明，miR-224-5p的表達(dá)可以抑制許多癌癥的增殖、遷移[18-20]，并有研究報(bào)道m(xù)iR-224-5p影響HepG2細(xì)胞脂質(zhì)攝取與蓄積[21]。本研究中circ-SFMBT2下調(diào)促進(jìn)了miR-224-5p的表達(dá)，而miR-224-5p下調(diào)則恢復(fù)了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)circ-SFMBT2可以與miR-224-5p相互作用。

circRNA通過(guò)充當(dāng)ceRNA來(lái)調(diào)控miRNA和靶基因表達(dá)。利用TargetScan推測(cè)發(fā)現(xiàn)USP3是miR-224-5p作用靶點(diǎn)。本研究中將含有miR-224-5p結(jié)合位點(diǎn)的USP3-3′UTR野生型和突變體序列構(gòu)建到了熒光素報(bào)告載體上，和miR-224-5p過(guò)表達(dá)mimic的片段一起轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型USP3-3′UTR和miR-224-5p mimic的熒光活力降低，說(shuō)明USP3-3′UTR和miR-224-5p之間存在靶向作用關(guān)系。同時(shí)根據(jù)研究報(bào)道，USP3可能作為一種致癌基因，促進(jìn)多種類型癌癥的進(jìn)展[22]，比如USP3基因敲除對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖和體內(nèi)成瘤的具有抑制作用；USP3通過(guò)去泛素化可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲；USP3可影響胃癌患者的預(yù)后[23]。在干擾circ-SFMBT2或過(guò)表達(dá)miR-224-5p條件下，過(guò)表達(dá)USP3可以恢復(fù)肝癌細(xì)胞的遷移和增殖能力，有研究發(fā)現(xiàn)海綿狀 miR-224下調(diào)USP3作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNA 促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移[24]。這與本次生物學(xué)分析和靶向?qū)嶒?yàn)結(jié)果相似。

綜上，circ-SFMBT2可通過(guò)靶向miR-224-5p/USP3軸來(lái)調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和遷移，下調(diào)circ-SFMBT2可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和遷移能力，提示circ-SFMBT2是一個(gè)潛在的肝癌防治靶點(diǎn)，因此需要對(duì)circ-SFMBT2/miR-224-5p/USP3軸進(jìn)行進(jìn)一步的研究，可為開(kāi)發(fā)新的肝癌治療策略提供基礎(chǔ)。