林正英， 楊光偉， 白嬌， 黃建

(1.自貢市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 四川 自貢 643000； 2.都江堰市婦幼保健院 檢驗(yàn)科, 四川 都江堰 611830; 3.自貢市中醫(yī)醫(yī)院檀木林分院 針灸一科, 四川 自貢 643000)

mtDNA突變和核編碼因子的突變會(huì)導(dǎo)致廣泛的人類疾病，其中大多數(shù)會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]。mtDNA最初被認(rèn)為在不受包裝蛋白質(zhì)束縛的情況下自由漂浮在線粒體基質(zhì)中，現(xiàn)在已經(jīng)確定mtDNA與線粒體內(nèi)膜有關(guān)[2]，其功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致核苷酸結(jié)構(gòu)和組成的改變，從而可能反過(guò)來(lái)影響mtDNA的分離和膜結(jié)構(gòu)，從而誘發(fā)線粒體疾病[3]。膽固醇動(dòng)態(tài)平衡紊亂可導(dǎo)致mtDNA異常[4]，參與調(diào)控該作用的因子包括ATAD3、ATPase家族以及AAA+結(jié)構(gòu)域[5]。大多數(shù)物種只有1個(gè)ATAD3基因，而人類則有一個(gè)緊密排列的ATAD3C、ATAD3B和ATAD3A 3個(gè)基因簇，它們緊密靠近1p號(hào)染色體的端粒[6]，ATAD3A突變能夠?qū)е戮€粒體異常表型[7-9]，其機(jī)制尚不明確。本研究旨在探究ATAD3基因簇缺失導(dǎo)致與mtDNA和膽固醇代謝相關(guān)的小腦功能障礙的關(guān)系，以為臨床診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

8～12周雄性C57BL/6(n=48)小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041]，將其隨機(jī)分為對(duì)照組(正常雄性C57BL/6小鼠，n=24)和Atad3缺失組(Atad3 -/-純合缺失C57BL/6小鼠，n=24)，飼養(yǎng)在室溫下、以12 h明/暗交替周期的無(wú)病毒-抗原設(shè)施中，可隨意獲得食物和水。

1.2 方法

從敲除小鼠項(xiàng)目庫(kù)中獲得了胚胎干(ES)細(xì)胞克隆，其中內(nèi)源Atad3已通過(guò)同源重組(http://www.komp.org)進(jìn)行修飾。將含有Atad3陷阱基因的ES細(xì)胞系(克隆CDS37385，來(lái)自JM8.N4細(xì)胞，背景6N)注入C57BL/6J衍生的胚泡中，獲得的胚胎植入假孕的寄養(yǎng)母親體內(nèi)。為了檢測(cè)嵌合體，本研究擴(kuò)增了煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(Nnt)基因座，該基因座在6N背景下為純合野生型(ES細(xì)胞)，而在6J背景下為純合突變體(胚泡)。用于擴(kuò)增Nnt基因的引物如下：NntA-COMMON為5′-GTAGGGCCAACTGTTTCTGCATGA-3′，NntD-WT為5′-GGGGATAGGAAGCAAATACCAAGTTG-3′，NntC-MUT為5′-GTGGAATTCCGCTGAGAGAACTCTT -3′。使雜合的Atad3 +/-小鼠與普遍表達(dá)翻轉(zhuǎn)酶小鼠(Rosa26_FLP，Jackson Laboratory，012930)交配，以切除新霉素選擇標(biāo)記。與雜合小鼠Atad3 +/-自交產(chǎn)生的純合后代Atad3 -/-小鼠用于表型研究的所需基因型，隨后將小鼠與C57BL6J一起繁殖了7代以上，取第子代小鼠的成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1采用RT-qPCR檢測(cè)ATAD3 mRNA表達(dá)水平 用異氟烷麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，斷頭處死，取小腦，-80 ℃儲(chǔ)存，組織勻漿，分離RNA，定量RNA濃度和純度；用DNase I(Promega公司，美國(guó))在37 ℃下處理等量的RNA(1 μg)30 min，在65 ℃滅活DNase 15 min。使用高容量cDNA存檔工具包(Applied Biosystems公司，美國(guó))對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Taqman qPCR使用JumpStart Taq Readymix(Sigma公司，美國(guó))和ATAD3小鼠特異性Applied Biosystems引物，反應(yīng)方案包括一個(gè)初始升溫時(shí)間(2 min，50 ℃；10 min，95 ℃)和40個(gè)后續(xù)循環(huán)(15 s，95 ℃；1 min，60 ℃)。與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)濃度。

1.3.2蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平 用異氟烷麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，斷頭處死。取小腦于-80 ℃儲(chǔ)存、勻漿，測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，并在540 nm處測(cè)量吸光度。將蛋白質(zhì)在95 ℃的樣品緩沖液(62.5 mmoL/L Tris-HCl，20%甘油，2%十二烷基硫酸鈉，5%β-巰基乙醇，pH6.8)中變性,等量的蛋白質(zhì)上樣到預(yù)制的聚丙烯酰胺NuPage凝膠(Invitrogen公司，美國(guó))中；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%牛奶的Tris緩沖鹽水(TBS，pH7.6)和1%Tween(TBS-T)封閉膜，加入含5%IgG的牛血清白蛋白的一抗(BSA公司，美國(guó))、4 ℃過(guò)夜，并在5%牛奶TBS-T中于室溫下過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(BSA公司，美國(guó)),顯影，計(jì)算條帶的光密度。

1.3.3采用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢查線粒體形態(tài) 活細(xì)胞用MitoTracker Red(紅色，線粒體)和PicoGreen(綠色，核和mtDNA)染色，將成纖維細(xì)胞以2×104接種在12 mm玻璃蓋玻片上，用抗TOMM20(上海碧云天公司)和LAMP1(上海碧云天公司)的一抗以及Alexafluor偶聯(lián)二抗(上海碧云天公司)進(jìn)行孵育，在37 ℃下用PicoGreen 3 mL將細(xì)胞染色30～45 min，向介質(zhì)中添加50 nmol/L MitoTracker Red染料(上海碧云天公司)或50 nmol/L MitoTracker Deep Red染料(上海碧云天公司)以可視化線粒體網(wǎng)絡(luò)。來(lái)自固定樣本和實(shí)時(shí)樣本的圖像均在由Metamorph軟件操作的Olympus旋轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)(Olympus公司，日本)上獲取。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的線粒體形態(tài)。

1.3.4采用溶酶體聚集體圖像分析溶酶體結(jié)構(gòu) 通過(guò)免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢查成纖維細(xì)胞系中的溶酶體結(jié)構(gòu)，抗TOMM20(紅色，線粒體)和LAMP1(綠色，溶酶體)的抗體染色，對(duì)圖像中正常和增大的溶酶體的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分，以定量分析溶酶體聚集體的存在。

1.3.5采用PureLink Genomic DNA Mini Kit分析mtDNA拷貝數(shù) 從小鼠成纖維細(xì)胞中提取總基因組DNA(gDNA)與核和mtDNA，使用QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Invitrogen公司，美國(guó))通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)。

1.3.6采用HPLC-質(zhì)譜法測(cè)定小鼠的肌肉脂質(zhì) 取2月齡對(duì)照組小鼠和Atad3缺失組小鼠的肌肉組織，用正相HPLC分離甘油磷脂和鞘脂，HPLC條件為Agilent Zorbax Rx-Sil色譜柱(柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑0.25 mm)：流動(dòng)相A(氯仿 ∶甲醇 ∶氫氧化銨=89.9 ∶10 ∶0.1，V/V)和流動(dòng)相B(氯仿 ∶甲醇 ∶水 ∶氫氧化銨，55 ∶39.9 ∶5 ∶0.1，V/V)，95%A持續(xù)2 min，在18 min內(nèi)線性梯度達(dá)到30%A，并保持3 min。通過(guò)反相HPLC分離甾醇和甘油脂，不同的是使用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 μm ×100 μm)。

1.3.7旋轉(zhuǎn)腳架下落的潛伏時(shí)間 采取rotarod試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，用旋轉(zhuǎn)腳架下落的潛伏時(shí)間評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)的學(xué)習(xí)能力以及肢體的協(xié)調(diào)能力。各組小鼠在造模前均進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，連續(xù)3 d，即在速度為4 r/min的轉(zhuǎn)輪上勻速訓(xùn)練跑輪，入組標(biāo)準(zhǔn)為至少持續(xù)60 s。在術(shù)后第1、7、14、21及28天，各組小鼠分別使用3個(gè)旋轉(zhuǎn)速度(8、16、24、32和40 r/min)進(jìn)行rotarod試驗(yàn)，記錄其行為學(xué)評(píng)分。使用旋轉(zhuǎn)腳架設(shè)備測(cè)量運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡，在每次試驗(yàn)中，活塞桿均在120 s內(nèi)加速至最終速度，在最終速度下再保持30 s，最后在30 s內(nèi)降至0 s，間隔時(shí)間為 2 min，記錄每個(gè)試驗(yàn)的旋轉(zhuǎn)腳架下落的潛伏時(shí)間，即小鼠從開始至跌落的時(shí)間，重復(fù)3次，計(jì)算其平均值。整個(gè)過(guò)程由對(duì)實(shí)驗(yàn)分組毫不知情的實(shí)驗(yàn)人員操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATAD3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，Atad3缺失組的ATAD3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Atad3缺失對(duì)ATAD3蛋白表達(dá)的影響

表1 兩組ATAD3 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2 線粒體形態(tài)

與對(duì)照組比較，Atad3缺失組纖維細(xì)胞中可視化的線粒體網(wǎng)絡(luò)碎片化，線粒體斷裂和部分?jǐn)嗔驯壤黾?，線粒體中間和融合比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 兩組細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)變化

圖2 兩組成纖維細(xì)胞線粒體共聚焦顯微鏡檢查

2.3 溶酶體結(jié)構(gòu)

與對(duì)照組比較，Atad3缺失組溶酶體液泡增大，正常溶酶體比例降低，增大溶酶體比例升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 兩組成纖維細(xì)胞中溶酶體結(jié)構(gòu)比較

表3 兩組成纖維細(xì)胞系中的溶酶體結(jié)構(gòu)比較

2.4 mtDNA拷貝數(shù)

與對(duì)照組比較，Atad3缺失組mtDNA拷貝數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的mtDNA核苷數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組mtDNA拷貝數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的mtDNA核苷數(shù)

2.5 小鼠肌肉組織膽固醇水平

在從2月齡鼠的肌肉中提取的樣品中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠和Atad3缺失組小鼠的脂質(zhì)組成的明顯差異(圖3A)。與對(duì)照組比較，5月齡Atad3缺失組小鼠肌肉組織有不同的膽固醇酯分布(圖3B)。Atad3缺失組肌肉在，ER中合成的膽固醇酯水平降低(通常含有短的飽和或單不飽和酰基鏈)，從飲食中獲得的膽固醇酯水平升高(通常含有更長(zhǎng)和更多的不飽和酰基鏈)；總膽固醇酯/游離膽固醇的定量水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 總膽固醇相關(guān)的不同膽固醇酯肌肉組織脂肪分析

表5 肌肉組織總膽固醇/游離膽固醇比值

2.6 旋轉(zhuǎn)腳架下落的潛伏時(shí)間

不同的旋轉(zhuǎn)速度(8、16、24、32和40 r/min)下，Atad3缺失組小鼠旋轉(zhuǎn)腳架下落潛伏時(shí)間低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 兩組小鼠旋轉(zhuǎn)腳架下落的潛伏時(shí)間比較

3 討論

本研究使用ATAD3基因敲除小鼠模型研究了線粒體內(nèi)膜ATPase ATAD3的體內(nèi)功能。ATAD3的缺失可導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)受損，mtDNA復(fù)制停滯，總膽固醇酯/游離膽固醇的比率降低，以及小腦功能障礙。線粒體在類固醇生成中具有重要作用[10-11]。膽固醇產(chǎn)物的缺乏可誘發(fā)伴隨ATAD3缺失的小腦功能異常。與致命的嬰兒ATAD3B/ATAD3A基因融合缺陷相反，隱性和從頭顯性的ATAD3A錯(cuò)義突變與輕度形式的小腦功能障礙和更廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和多系統(tǒng)疾病有關(guān)[12]，即ATAD3A的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致ATAD3的一部分功能喪失或引起功能異常，而不是因?yàn)锳TAD3A位點(diǎn)的雙等位基因缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的蛋白質(zhì)缺乏[13]。在ATAD3缺失動(dòng)物中，mtDNA的減少伴隨著mtDNA重排的形成，該重排在年長(zhǎng)的動(dòng)物中積累[14]。保留的mtDNA序列包括D環(huán)區(qū)域以及12S和16S核糖體RNA基因。這種缺失模式與在病理狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的重排分子非常相似，例如成人發(fā)作性進(jìn)行性眼外肌麻痹和MNGIE[15]。

本研究顯示，ATAD3缺失導(dǎo)致纖維細(xì)胞中可視化的線粒體網(wǎng)絡(luò)碎片化，線粒體斷裂和部分?jǐn)嗔驯壤黾?，線粒體中間和融合比例降低。線粒體是影響膽固醇代謝的關(guān)鍵細(xì)胞器，而ATAD3調(diào)節(jié)線粒體的膽固醇供應(yīng)。由ATAD3缺乏引起的膽固醇生物合成的線粒體信號(hào)優(yōu)先于細(xì)胞的其余部分，這表明將線粒體膽固醇水平保持在嚴(yán)格范圍內(nèi)非常重要[16]。膽固醇代謝紊亂對(duì)mtDNA的影響表明，將膽固醇插入線粒體內(nèi)膜對(duì)于mtDNA復(fù)制和分離很重要[17]。線粒體內(nèi)膜中的膽固醇含量低或分散，有望改變其剛性，從而阻礙mtDNA分離[18]。膽固醇和線粒體的完整性都與神經(jīng)變性有關(guān)。本研究顯示，在5周齡的動(dòng)物中，與對(duì)照組比較，Atad3缺失組肌肉中總膽固醇酯/游離膽固醇的定量水平降低。膽固醇可能是與ATAD3缺陷相關(guān)的病理學(xué)的關(guān)鍵因素，該觀點(diǎn)得到了與膽固醇相關(guān)的遺傳性疾病中小腦功能障礙的支持[19]。小腦在調(diào)節(jié)高階認(rèn)知和行為功能中起著重要作用，小腦發(fā)育不全通常與Smith-Lemli-Opitz綜合征有關(guān)，后者是膽固醇合成的隱性疾病，而小腦功能障礙是C型Niemann-Pick疾病的特征[20]。存在mtDNA異常C型Niemann-Pick疾病和ATAD3缺失障礙表明，這些可能是小腦病理的主要驅(qū)動(dòng)因素。本研究顯示，ATAD3缺失導(dǎo)致小腦功能障礙，線粒體內(nèi)膜AAA蛋白ATAD3A的功能在膽固醇向線粒體的運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用， AAA蛋白是通過(guò)形成六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生作用，ATP酶的催化作用需要底物的配合，且異常線粒體過(guò)度分裂形態(tài)與溶酶體空洞有密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述，ATAD3缺失主要破壞了線粒體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體斷裂，并增加了溶酶體液泡大小，導(dǎo)致膽固醇向線粒體的運(yùn)輸被下調(diào)，mtDNA復(fù)制停滯以及mtDNA的耗竭和缺失，最終導(dǎo)致小腦功能障礙。