陳思憶， 王銘菊， 湯磊， 陳俊， 黃家宇*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550000； 2.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心， 貴州 貴陽 550000)

對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種廣泛使用的非處方解熱鎮(zhèn)痛藥，常用劑量治療時(shí)間為3 d，最多不超過7 d，過量服用或超期服用可致藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)，甚至肝衰竭及死亡[1-4]。故開發(fā)出一種APAP的復(fù)方制劑，超期或誤服APAP的情況下能保護(hù)肝臟不受到損傷，對提高APAP的應(yīng)用范圍和使用中的安全性顯得尤為重要。腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methionine，SAMe)是人體內(nèi)一種重要的輔酶，可作為生物代謝甲基供體、硫基供體及轉(zhuǎn)氨丙基供體，參與體內(nèi)許多重要的生化反應(yīng)，補(bǔ)充外源性SAMe對APAP所致的藥物性肝損傷有較好的治療作用[5-8]。目前國內(nèi)外關(guān)于APAP所致大鼠肝損傷保護(hù)作用的研究多以急性肝損傷的研究為主，而對于慢性肝損傷保護(hù)作用的研究較少[9-11]。因此，研究不同劑量APAP-SAMe復(fù)方制劑在長期給藥條件下對大鼠肝損傷的保護(hù)作用，對提升APAP的應(yīng)用安全性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)也為開發(fā)一種APAP低毒性的復(fù)方制劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康Sprague Dawley(SD)大鼠，specific pathogen free(SPF)級，體質(zhì)量180～220 g，實(shí)驗(yàn)動物均購自學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(黔)2018-0001]。大鼠飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境中，溫度23～25 ℃，相對濕度(55±5)%，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器)，OSE-Y30組織研磨器(北京天根生化)，VARIOSKANLUX多功能酶標(biāo)儀(美國Themo Fisher Scientific )，AUY120分析天平和UV2700紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)，微量移液器(德國Eppendorf)。

1.1.3主要藥物與試劑 APAP及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC；源葉生物)，SAMe(西安四季生物)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBiL)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物)，10%中性甲醛固定液(成都里來生物)。

1.2 方法

1.2.1給藥和分組 SD雄性大鼠60只隨機(jī)均分為正常對照組(生理鹽水灌胃)、APAP組(210 mg/kg APAP)、低劑量APAP+SAMe組(210 mg/kg APAP+53 mg/kg SAMe)、中劑量APAP+SAMe組(210 mg/kg APAP+105 mg/kg SAMe)、高劑量APAP+SAMe組(210 mg/kg APAP+210 mg/kgSAMe)及陽性對照組(210 mg/kg APAP+200 mg/kg NAC)，APAP的給藥劑量根據(jù)臨床每日最大劑量換算，SAMe低劑量組為成人等效劑量；正常對照組灌胃生理鹽水，各組給予相應(yīng)藥物灌胃1次/d，連續(xù)30 d，

1.2.2一般情況觀察 觀察灌胃期間的各組大鼠的精神狀態(tài)、行為活動、飲食情況、二便情況及皮膚毛色等。

1.2.3血清指標(biāo)檢測 各組大鼠在末次給藥16 h后，按照0.35 g/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取全血置潔凈試管，靜置1 h，4 000 r/min離心10 min，分離血清，利用多功能酶標(biāo)儀測定血清中ALT、AST、LDH及TBiL的含量。

1.2.4肝臟稱重 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠肝臟，4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干水分、稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)[肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%]。

1.2.5肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取“1.2.4”項(xiàng)下大鼠肝臟組織，置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理形態(tài)學(xué)特征，包括炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉肝索排列，肝細(xì)胞壞死等情況。

1.2.6肝組織GSH、SOD及MDA的測定 取“1.2.4”項(xiàng)下大鼠肝臟組織稱重，按照質(zhì)量(g) ∶體積(mL)為1 ∶9的比例加4℃的0.9%生理鹽水，組織勻漿機(jī)10 000 r/min冰浴中研磨制備10%肝勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書使用半自動生化分析儀測定大鼠肝組織中GSH、SOD及MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組大鼠毛發(fā)滑順，有光澤，精神狀態(tài)良好，行動靈活，二便正常；APAP組大鼠體質(zhì)量減輕，毛發(fā)無光澤，精神狀態(tài)欠佳，喜臥；相比于APAP組，SAMe給藥組和陽性對照組大鼠在毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、體質(zhì)量情況以及行動靈活性情況有不同程度的改善。

2.2 血清ALT、AST、TBiL及LDH

結(jié)果顯示，與正常對照組相比，APAP組大鼠血清中ALT、AST、TBiL及LDH活力均明顯升高(P<0.01)，證明長期服用APAP對大鼠造成了肝損傷；與APAP組比較，除低劑量SAMe組大鼠血清TBiL外(P>0.05)，SAMe不同給藥劑量組可降低血清中ALT、AST、LDH的活力(P<0.01或P<0.05)。見圖1。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；與APAP組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。

2.3 肝組織GSH、SOD、MDA及肝臟指數(shù)

結(jié)果顯示，與正常對照組相比，APAP組大鼠肝組織中MDA水平明顯增加，GSH、SOD活性明顯降低，肝臟指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明長期服用APAP對大鼠造成了肝損傷；與APAP組相比，除低劑量SAMe組大鼠肝組織GSH、MDA外(P>0.05)，不同給藥劑量組均能升高SOD與GSH活力，降低MDA水平，使肝臟指數(shù)趨于正常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；與APAP組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05。

2.4 大鼠肝臟組織學(xué)變化

正常對照組大鼠肝臟表面光滑、顏色暗紅，鏡下觀察肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰可辨；APAP組大鼠肝臟腫大，有大量點(diǎn)狀出血，鏡下可見細(xì)胞核破裂，肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉肝索不規(guī)則排列；與APAP組比較，低劑量SAMe組大鼠肝組織仍能看到多個(gè)壞死灶，大部分炎細(xì)胞浸潤；中劑量SAMe組大鼠肝組織在電鏡下觀察到大片壞死明顯減輕，間質(zhì)內(nèi)仍可見炎性細(xì)胞的浸潤；陽性對照組及高劑量SAMe組大鼠肝細(xì)胞部分變性，無明顯帶狀壞死，可見少量炎性細(xì)胞；各組大鼠肝臟組織炎癥恢復(fù)程度大小依次表現(xiàn)為陽性對照組及高劑量組>中劑量組>低劑量組。見圖3。

注：A～F分別為正常對照組、APAP組、SAMe低劑量組、SAMe中劑量組、SAMe高劑量組及陽性對照組。

3 討論

APAP常用劑量一般小于2 g/d，成人最大推薦劑量為4 g/d，若超期或超劑量服用可致肝損傷[12-13]。短期內(nèi)攝入正常劑量的APAP時(shí)，其90%～95%在肝臟內(nèi)與葡萄糖醛酸或硫酸鹽結(jié)合形成無毒性物質(zhì)，經(jīng)腎臟排泄[14]。其中約5%的APAP經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生有毒的NAPQI，肝細(xì)胞內(nèi)GSH結(jié)合可解毒。當(dāng)長期或過量攝入APAP時(shí)，GSH耗竭，NAPQI與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白共價(jià)結(jié)合，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[15]。SAMe的轉(zhuǎn)甲基作用促進(jìn)肝細(xì)胞膜磷脂甲基化，增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動性，抑制膽汁酸的淤積[16-17]；轉(zhuǎn)巰基作用能生成半胱氨酸和GSH等內(nèi)源性解毒劑，可與有毒物質(zhì)NAPQI結(jié)合，在肝細(xì)胞解毒過程中發(fā)揮著重要作用[18]。APAP產(chǎn)生ROS、谷胱甘肽耗竭及過氧化脂質(zhì)的能力被認(rèn)為是導(dǎo)致肝損傷的主要原因[19-23]。GSH、SOD和MDA三個(gè)指標(biāo)的測定常配合使用，用于評價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)平衡，或在失衡后造成的氧化損傷狀態(tài)。

在肝損傷模型的動物性別選擇上，路燕等[24]通過比較不同性別的小鼠對于肝損傷敏感性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠在APAP給藥后，血清ALT水平升高更明顯;肝臟病理損傷更嚴(yán)重;肝細(xì)胞氧化損傷更嚴(yán)重，表明雄性小鼠相較于雌性小鼠APAP肝臟損傷更嚴(yán)重，同時(shí)結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，故參考相關(guān)文獻(xiàn)選用了雄性大鼠進(jìn)行肝損傷模型的建立。

本研究以APAP(210 mg/kg)配伍不同劑量SAMe(53、105及210 mg/kg)，APAP劑量210 mg/kg是由臨床成人每日最大劑量換算而得，SAMe低劑量53 mg/kg是臨床成人等效劑量，中劑量105 mg/kg是等效劑量的2倍，高劑量210 mg/kg是等效劑量的4倍，不同給藥劑量是為找到制備復(fù)方制劑最合適的配比。結(jié)果顯示，當(dāng)長期攝入APAP后，大鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p害，血清中ALT、AST、TBiL及LDH水平明顯升高，肝臟中MDA含量升高，SOD和GSH活性降低；肉眼可見肝臟明顯腫大，病理學(xué)切片在光鏡下有明顯炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死，肝臟指數(shù)顯著升高；配伍SAMe使用后，大鼠肝損傷得到不同程度減輕；低劑量SAMe組較APAP組的ALT、AST及LDH活力降低，SOD活力升高，TBiL、GSH及MDA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且病理學(xué)切片仍有多個(gè)壞死灶，炎細(xì)胞浸潤明顯，但肝臟指數(shù)趨于正常，說明低劑量SAMe對APAP所致的肝損傷有拮抗作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中劑量SAMe組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)和肝臟指數(shù)與APAP組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，但病理學(xué)切片在光鏡下仍有部分壞死，炎性細(xì)胞浸潤；高劑量SAMe能明顯降低大鼠血清ALT、AST、TBiL、LDH和肝組織MDA水平，明顯增加肝組織SOD和GSH的活性，病理學(xué)切片少見炎性細(xì)胞，其他無任何病變，肝臟指數(shù)接近正常水平，說明SAMe配伍APAP能拮抗對大鼠肝臟造成的損傷，高劑量SAMe拮抗作用明顯。其原因可能是GSH在協(xié)調(diào)抗氧化防御過程中起著核心作用，APAP配伍SAMe使用，SAMe能阻止APAP引起的GSH耗竭，從而保護(hù)細(xì)胞免受APAP引起ROS釋放的損傷[25-26]。

綜上所述，較長時(shí)間服用APAP對肝臟有嚴(yán)重?fù)p害作用，與SAMe配伍則可以減輕這種損傷。為規(guī)避藥物性肝損傷，可將APAP和SAMe制成一種復(fù)方制劑用于臨床，既能減少較長時(shí)間內(nèi)服用APAP造成的肝損傷，又能減少由于誤服過量APAP可能誘導(dǎo)的肝損傷。