羅才榮, 劉杰, 梁妍, 盛鈺, 何芋岐, 周威*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 遵義 563099)

飛龍掌血[Toddaliaasiatica(L.) Lam.]為蕓香科、飛龍掌屬植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為該藥具有止血、散瘀、止痛和祛風(fēng)的功效[1-2]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)飛龍掌血總生物堿具有顯著抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]。鑒于炎癥與癌癥、糖尿病及哮喘等諸多疾病密切相關(guān)[4-7]，開展抗炎藥物研究就顯得尤為重要。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa beta,NF-κB)可以介導(dǎo)炎癥發(fā)生的各個(gè)階段，它通過調(diào)控炎癥基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；IκB激酶β(IκB kinase β, IKK-β)是抑制NF-κB通路的關(guān)鍵激酶，當(dāng)IKK-β被激活產(chǎn)生聯(lián)級(jí)反應(yīng)導(dǎo)致NF-κB被異常激活，可產(chǎn)生大量的炎癥因子；絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)具有與IKK-β相似的作用；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2, COX-2)都是NF-κB調(diào)節(jié)的基因[8-10]。TNF-α可以反向的作用于NF-κB形成正反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)TNF-α 被抑制后可以減輕炎癥條件下產(chǎn)生的疼痛[8]；iNOS是一種細(xì)胞間信使，通過NF-κB刺激上調(diào)COX-2和iNOS增加細(xì)胞因子的表達(dá)，激活中樞和外周疼痛[10]；巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibition factor, MIF)是炎癥反應(yīng)中上游的介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)產(chǎn)生[11]；這些抗炎因子受體是炎癥研究中重要的研究對(duì)象[12-15]。分子對(duì)接技術(shù)屬于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer-aided drug design, CADD)的重要組成部分，分子對(duì)接是將配體小分子放到受體活性口袋中，通過變化配體小分子的空間構(gòu)象，按照幾何、能量及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來(lái)評(píng)價(jià)配體小分子與受體互相作用的強(qiáng)弱, 預(yù)測(cè)其結(jié)合模式、親和力的方法[16]。結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)[3]，本研究通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選手段進(jìn)一步豐富飛龍掌血抗炎活性生物堿，并分析其可能的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1平臺(tái)和軟件 本研究所有的操作均在Windows操作系統(tǒng)中完成的，化學(xué)結(jié)構(gòu)繪圖軟件，分子對(duì)接軟件。軟件中參數(shù)設(shè)置未說(shuō)明，均為默認(rèn)值。

1.1.2靶點(diǎn)、上市藥物和候選化合物 選取7個(gè)與炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，即NF-κB1、IKK-β、p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)、TNF-α、MIF、iNOS及COX-2。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)搜索并下載對(duì)應(yīng)的晶體蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank, PDB)編號(hào)及原配體與靶點(diǎn)殘基作用情況(表1)。在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(www.drugbank.ca)檢索到12個(gè)對(duì)上述靶點(diǎn)有抑制作用并己批準(zhǔn)上市的小分子藥物(表 2)，下載其化合物結(jié)構(gòu)。從本課題組對(duì)飛龍掌血的綜述[17]及現(xiàn)有報(bào)道中得到65個(gè)生物堿化合物，通過PubChem化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載其3D構(gòu)象。

表1 原配體與靶點(diǎn)殘基作用情況

表2 與靶點(diǎn)有抑制作用的已上市小分子藥物

1.2 方法

1.2.1靶點(diǎn)蛋白的處理 在分子對(duì)接軟件中對(duì)所有的蛋白進(jìn)行前處理，即刪除水分子、原配體分子及其非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，經(jīng)Clean Protein、Preare Protein工具等處理。定義蛋白為受體，并將其定義sphere球，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2類藥五規(guī)則(Lipinski)[18]篩選候選化合物 使用Lipinski對(duì)候選的65個(gè)飛龍掌血生物堿類化合物進(jìn)行篩選，包括：(1)分子量<500;(2)氫鍵給體數(shù)目<5;(3)氫鍵受體數(shù)目<10;(4)脂水分配系數(shù)<5;(5)可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量<10。

1.2.3候選化合物和上市藥物的處理 將符合類藥性原則的化合物構(gòu)建出其3D構(gòu)象并導(dǎo)入分子對(duì)接軟件中進(jìn)行加氫、Prepare ligands處理，最后進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，保存?zhèn)溆?。上市小分子藥物與候選的生物堿類小分子同法處理，保存作為參照配體庫(kù)。

1.2.4對(duì)接方法可行性驗(yàn)證 將蛋白晶體中的原配體抽離，然后按設(shè)定的參數(shù)對(duì)接回原口袋，計(jì)算對(duì)接后的構(gòu)象與原配體的均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)，通過RMSD值測(cè)定該對(duì)接方法和參數(shù)的可行性。

1.2.5候選化合物與靶點(diǎn)蛋白對(duì)接 將備用的靶點(diǎn)和配體分子導(dǎo)入分子對(duì)接軟件中，使用分子對(duì)接軟件中的Libdock組件，設(shè)置參數(shù)Conformation Method為FAST，Docking Preferences為High Quality，運(yùn)行。同法操作，將已上市的藥物小分子與靶點(diǎn)對(duì)接。靶點(diǎn)1A9U的空間坐標(biāo)位置為8.429 6、12.819 7及31.194 7，靶點(diǎn)1LJT的空間坐標(biāo)位置為-33.160 0、33.626 7及-4.868 9，靶點(diǎn)2AZ5的空間坐標(biāo)位置為-17.423 3、73.104 4及36.976 9，靶點(diǎn)3RZF的空間坐標(biāo)位置為96.425 7、-28.150 7及55.284 6，靶點(diǎn)3HR4的空間坐標(biāo)位置為-0.278 4、12.720 3及-70.238 8，靶點(diǎn)1AM4的空間坐標(biāo)位置為45.669 8、-50.205 1及8.194 6，靶點(diǎn)3KRK的空間坐標(biāo)位置為31.666 1、35.605 0及65.043 3。對(duì)接完成后，以各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)上市藥物最低評(píng)分做第1次篩選，然后把篩選出的小分子配體與原配體的最低評(píng)分做2次篩選，保留高于雙閾值配體，并刪除重復(fù)項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 符合Lipinski的化合物

使用Lipinski篩選后得到19個(gè)符合條件的生物堿類小分子化合物。

2.2 對(duì)接方法的可行性

在7個(gè)靶點(diǎn)的可行性驗(yàn)證結(jié)果中，得到對(duì)接后構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的RMSD值均小于2×10-10m，且對(duì)接構(gòu)象與原配體疊合圖大致重合，說(shuō)明該方法的對(duì)接參數(shù)設(shè)定具有可行性(表3)。

表3 靶點(diǎn)蛋白與其原配體對(duì)接結(jié)果

2.3 候選化合物-靶點(diǎn)對(duì)接分析

將19生物堿類候選化合物進(jìn)行分子對(duì)接，最終篩選出對(duì)接評(píng)分高于對(duì)各靶點(diǎn)有抑制作用藥物及其原配體最低得分值的化合物共28個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后最終得到14個(gè)小分子化合物見表4，表中列出19個(gè)候選化合物與不同靶點(diǎn)的對(duì)接打分情況。高于閾值的化合物與靶點(diǎn)作用情況如下：Demethylnitidine (Cp.15)作用于MIF、NF-κB1和COX-2靶點(diǎn)，以該化合物為例展示其與靶點(diǎn)的作用模式圖(圖 1)；1, 3-二環(huán)己基(Cp.06)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶點(diǎn)；N-反式-阿魏酰酪胺(Cp.10)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶點(diǎn)；(7Z)-N-(4′-methoxyphenethyl)-3-methoxy-4-hydrox ycinnamamide (Cp.12)作用于IKK-β、MAPK和MIF靶點(diǎn)；5-甲氧基白蘚堿(Cp.08)作用于IKK-β、COX-2靶點(diǎn)；光葉花椒堿(Cp.13)作用于MIF、iNOS和NF-κB1靶點(diǎn)；飛龍掌血喹啉(Cp.19)作用于TNF-α和MIF靶點(diǎn)，木蘭花堿(Cp.16)作用于IKK-β和COX-2靶點(diǎn)；白屈菜紅堿(Cp.03)作用于TNF-α靶點(diǎn)，N,N′-二環(huán)己基草酰胺(Cp.11)作用于MAPK靶點(diǎn)；γ-崖椒堿(Cp.05)、4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮(Cp.09)、弗林德堿(Cp.01)和花椒喹諾酮(Cp.14)作用于IKK-β。

表4 原配體和19個(gè)生物堿類候選化合物得分

注：A為配體分子與受體蛋白對(duì)接空腔氫鍵作用，紫、綠色分別表示氫鍵供體和受體；B為配體分子與氨基酸殘基作用模式，綠色表示氫鍵連接的氨基酸殘基，淺綠色表示范德華力連接的氨基酸殘基，淺紫色表示π-烷基鍵連接的氨基酸殘基。

2.4 候選化合物與上市藥物，原配體的氨基酸殘基對(duì)接分析

分析上市藥物分子與各靶點(diǎn)間氫鍵和π相互作用(表5)及14個(gè)生物堿類小分子-靶點(diǎn)之間的氫鍵與π相互作用、對(duì)接方式和模式(表6)，該表展示了候選化合物-靶點(diǎn)-上市藥物之間氨基酸殘基的作用模式和作用數(shù)目，用以揭示藥物分子發(fā)揮抗炎的效果時(shí)可能結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)。通過化合物與上市藥物對(duì)靶點(diǎn)共同作用的氫鍵、π相互作用的多寡及方式，進(jìn)一步推斷其可能的抗炎作用機(jī)制。

表5 已上市藥物與各靶點(diǎn)殘基作用情況

表6 篩選出的化合物與各靶點(diǎn)殘基作用情況

3 討論

分子對(duì)接技術(shù)在藥效成分-藥理靶點(diǎn)作用方面具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，能夠較準(zhǔn)確的闡明待篩藥物可能的藥效與藥理作用機(jī)制，已經(jīng)逐漸被廣泛運(yùn)用于藥物分子設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)模型構(gòu)建、中藥藥效成分的發(fā)現(xiàn)與新藥研究開發(fā)、復(fù)雜藥物藥理作用機(jī)制研究中[19-22]。Lipinski是基于化學(xué)結(jié)構(gòu)模擬其在體內(nèi)的吸收效率及藥用性能的法則，能較為快速地篩選出天然產(chǎn)物中具有良好成藥性的藥物分子[18]。

本次研究基于Lipinski，采用高通量篩選方法LibDock對(duì)接模式對(duì)飛龍掌血生物堿類化合物進(jìn)行抗炎活性篩選，從65個(gè)飛龍掌血生物堿類化合物中，篩選到19個(gè)符合類藥性原則的候選化合物，提示它們具有良好的成藥性。但Lipinski有其自身的局限性，限定了分子量不符合該規(guī)則但可能具有良好藥理活性小分子。本研究旨在通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選手段發(fā)現(xiàn)飛龍掌血生物堿中抗炎活性與吸收均良好的天然化合物，對(duì)飛龍掌血生物堿類化合物進(jìn)行類藥性篩選。整理原配體、上市藥物和候選化合物與靶點(diǎn)的氨基酸作用情況，分析靶點(diǎn)中關(guān)鍵氨基酸與配體之間相互作用的相似性。

可行性驗(yàn)證中的RMSD值是衡量靶點(diǎn)蛋白能否進(jìn)行分子對(duì)接的重要指標(biāo)，該值能反應(yīng)出二次對(duì)接的配體與原配體之間的重復(fù)性，一般認(rèn)為當(dāng)RMSD<2×10-10m時(shí)，認(rèn)為該方法具有可行性[16]。本次對(duì)接的RMSD<2×10-10m，說(shuō)明本次對(duì)接中設(shè)置參數(shù)具有可操作性。

Demethylnitidine (Cp.15)可與MIF、NF-κB1和COX-2靶點(diǎn)產(chǎn)生較強(qiáng)的作用，其與上市藥物-靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果顯示在B(Tyr385)、C(Arg85)及F(Thr558)等氨基酸殘基形成相似的氫鍵作用，在A(Phe348)殘基出形成π相互作用。

N-反式-阿魏酰酪胺 (Cp.10)可與IKK-β、MAPK和COX-2靶點(diǎn)發(fā)生作用，與上市藥物-靶點(diǎn)對(duì)接中在A(Arg31、Lys44、Asp166、Leu167、Leu75、Leu87及Asp88等)殘基上形成共同的氫鍵；其中氨基酸殘基Arg31與原配體殘基對(duì)接一致。周鵬等[23]在研究甘草素、甘草苷和甘草酸與IKK-β靶點(diǎn)對(duì)接中發(fā)現(xiàn)Asp166可能是該靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)。鄭新恒等[24]將分離得到的N-反式-阿魏酰酪胺進(jìn)行抑制NO生成的研究，發(fā)現(xiàn)其抑制NO生成無(wú)明顯作用，IC50值為33.15 μmol/L，大于陽(yáng)性對(duì)照藥槲皮素(IC50=17.21 μmol/L)。

光葉花椒堿(Cp.13)與上市藥物和靶點(diǎn)MIF、iNOS及NF-κB的對(duì)接中在A(Lys549、Gly594及Ser628)、B(Ser60)、C(Cys59、Arg85)及F(Thr558)等氨基酸殘基有相同的氫鍵作用；與原配體形成A(Thr547、Glu661、Thr592)共同的氫鍵殘基，且與上市藥物和原配體在Tyr631產(chǎn)生相同的π相互作用，表明篩選出的化合物可能具有與上市藥物相似的抗炎活性。

白屈菜紅堿(Cp.03)與靶點(diǎn)TNF-α對(duì)接結(jié)果并未表現(xiàn)出與氨基酸的相互作用，但Li等[25]對(duì)白屈菜紅堿作用于腹膜炎癥介質(zhì)的研究表明其對(duì)TNF-α分泌具有極強(qiáng)的抑制作用。Banbury等[26]研究表明弗林德堿(Cp.01)能夠抑制鈣離子載體刺激的3T3中PGE2的合成，其中PGE2被認(rèn)為是主要的促炎前列腺素，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)也是通過該途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究從飛龍掌血中篩選出14個(gè)可能具有抗炎活性的生物堿類化合物，推測(cè)這14個(gè)化合物可能是飛龍掌血生物堿發(fā)揮抗炎活性的關(guān)鍵活性成分；其中有8個(gè)化合物至少與2個(gè)以上的蛋白具有良好的對(duì)接效果，說(shuō)明這8個(gè)化合物具有多靶向效應(yīng)，可能通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎的作用；靶點(diǎn)IKK-β、MAPK、MIF及COX-2與這14個(gè)化合物對(duì)接中高于閾值的化合物有13個(gè)，表明上述靶點(diǎn)可能是飛龍掌血生物堿發(fā)揮抗炎作用的重要靶點(diǎn)；弗林德堿、白屈菜紅堿被報(bào)道具有顯著抗炎作用，而N-反式-阿魏酰酪胺對(duì)抑制一氧化氮合酶的生成無(wú)明顯作用，證明了該化合物與iNOS靶點(diǎn)蛋白(3HR4)對(duì)接打分低的原因。本次研究初步探索了飛龍掌血生物堿類化合物可能發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制，這對(duì)于飛龍掌血生物堿類化合物抗炎作用的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了必要的理論依據(jù)。