張健， 彭煜暉， 李毅， 梁欣明， 付文莉， 張婷， 柏華， 禹文峰， 吳昌學(xué)*， 張啟芳*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室， 貴州 都勻 558000)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來，中國前列腺癌患者的病死率呈上升趨勢[1]。在前列腺癌初期，腫瘤生長具有雄激素依賴性，因此臨床上常采用雄激素剝奪治療[2-3]；但使用此方法治療2～3年后，前列腺癌可能會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌[4]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作為治療去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥物，其發(fā)揮抗腫瘤作用的原因之一是在細(xì)胞有絲分裂時(shí)可以作用于微管、從而抑制細(xì)胞的分裂[5-7]。但是，CRPC患者對PTX產(chǎn)生耐藥性后嚴(yán)重降低了其抗腫瘤效果，化學(xué)耐藥性CRPC是成年男性中最致命的癌癥[8]。因此，尋求克服CRPC患者對PTX抗性的有效療法顯得尤為重要。小檗堿(berberine，BBR)是一種常見的季銨生物堿化合物，可以從多種藥用植物中分離得到，比如黃連、蕓苔科植物等[9-10]。近年的研究表明BBR具有抗腫瘤的活性，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等[11-14]。BBR可通過下調(diào)高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)/Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞4T1的增殖及肺部轉(zhuǎn)移[15]，也可通過抑制磷脂酰肌醇激酶-絲蘇氨酸蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白信號通路來增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[16]。此外，在三陰性乳腺癌中BBR也可通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)的表達(dá)，從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移[17]。但是，BBR在人耐PTX去勢性前列腺癌細(xì)胞株DU145R中的作用尚不明確。因此，本研究探討黃連素對人耐PTX去勢性前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 人前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株DU145R為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，兔抗白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、兔抗信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducers andactivators of transcription3，STAT3)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔的二抗(美國CST),黃連素(中國大連美侖生物)，十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒(中國碧云天)，超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Millipore)，PTX和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑(上海翊圣)；瞬時(shí)離心機(jī)D1008E(美國SCILOGEX)，F(xiàn)ACS verse型流式細(xì)胞儀(美國BD)，2720 Themal cycler PCR儀(美國Applied Biosystem)，Step One Plus Real-time PCR system(美國Applied Biosystem)，GeneGnome XRO NPC 化學(xué)發(fā)光成像儀(英國SYNGENE)，Varioskan LUX多通道酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rda MiniⅡ/Ⅲ垂直電泳儀和Bio-Rda powerpacHC高流電源(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將人耐PTX前列腺癌細(xì)胞株DU145R細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的培養(yǎng)基，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) DMSO(0 μmol/L)BBR、10及20 μmol/L BBR處理對數(shù)生長期DU145R細(xì)胞72 h，分別為DMSO組(0 μmol/L BBR組)、10 μmol/L BBR組及20 μmol/L BBR組，收集各組細(xì)胞并利用Annexin V/PI雙染色法凋亡試劑盒檢測BBR對DU145R細(xì)胞凋亡的影響；按說明書要求上樣，流式細(xì)胞儀檢測；最后利用流式分析軟件FlowJo V6分析數(shù)據(jù)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR DMSO(0 μmol/L BBR)、10及20 μmol/L BBR處理DU145R細(xì)胞24 h，分別為0、10及20 μmol/LBBR組，提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，QPCR)檢測IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)水平。qPCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。IL-6引物∶上游5′-CCAGGAGCCCAGCTATGAAC -3′，下游5′- GATGCCGTCGA-GGATGTACC -3′。STAT3引物∶上游5′-CTGCCT-AGATCGGCTAGAAAAC-3，下游5′-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3′。β-actin引物：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGG-AGAAG-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA GTG-3′。最后利用公式2-ΔΔCt計(jì)算出STAT3及IL-6 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4蛋白印跡(Western blot)法 收集“1.2.2”項(xiàng)下各組DU145R細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白上樣30 μg，80 V恒壓電泳并將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，室溫下分別孵育IL-6一抗(1 ∶1 000)及STAT3一抗(1 ∶1 000)2 h，孵育抗兔二抗(1 ∶1 000)1 h，使用ECL超敏化學(xué)發(fā)光液檢測IL-6和STAT3蛋白表達(dá)，利用Image J分析圖像強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與DMSO組(0 μmol/L BBR組)相比，10和20 μmol/L BBR組DU145R細(xì)胞的凋亡數(shù)量均增加(P<0.05)，且具有濃度依賴性。見圖1。

注：A、B 分別為流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果和DU145R細(xì)胞凋亡定量結(jié)果； (1)與0 μmol/L BBR組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L BBR組比較，P<0.05。

2.2 IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，與0 μmol/L BBR組相比，10和20 μmol/L BBR組DU145R細(xì)胞中IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且具有濃度依賴性。見圖2。

注:A、B分別為IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)；(1)與0 μmol/L BBR組相比，P<0.05;(2)與10 μmol/L BBR組比較，P<0.05。

2.3 IL-6和STAT3蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，0 μmol/L組、10及20 μmol/L BBR組DU145R細(xì)胞的IL-6和STAT3的蛋白表達(dá)水平比較，0 μmol/L BBR組>10 μmol/L BBR組>20 μmol/L BBR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注:A為IL-6及STAT3蛋白表達(dá)；B、C分別為STAT3和IL-6定量結(jié)果； (1)與0 μmol/LBBR組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L BBR組比較，P<0.05。

3 討論

在臨床上，CRPC患者對PTX產(chǎn)生耐藥性極大的限制了PTX的作用[18]。因此，克服CRPC患者PTX耐藥性顯得尤為重要。在本研究中，與DMSO組相比，隨著BBR濃度的增加，DU145R細(xì)胞凋亡數(shù)量增加(P<0.05)，表明BBR能夠誘導(dǎo)DU145R細(xì)胞的凋亡，且具有濃度依賴性。與對照組相比，BBR下調(diào)了IL-6/STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，并且具有濃度依賴性，這個(gè)結(jié)果更進(jìn)一步的解釋的BBR誘導(dǎo)DU145R細(xì)胞的凋亡的分子機(jī)制。

BBR是黃連的主要活性成分之一，其主要作用是治療腸道感染[19]。但近年有研究表明，在人肺癌A549細(xì)胞中，BBR能夠抑制抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)，同時(shí)激活凋亡蛋白Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl2-Assaciated X protein，Bax)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡[20]。重要的是BBR也能誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，有研究表明，BBR通過激活活性氧/p38絲裂原活化蛋白激酶/半胱天冬酶信號途徑促進(jìn)順鉑耐藥黑色素瘤細(xì)胞的凋亡[21]。在慢性B淋巴細(xì)胞白血病患者中，BBR具有同樣的功效，可下調(diào)miR-21、Bcl-2及類受體酪氨酸激酶孤兒受體1(receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1，ROR1)的表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[22]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)BBR也能誘導(dǎo)DU145R細(xì)胞的凋亡(P<0.05)，并且具有濃度依賴性。在人前列腺癌細(xì)胞株DU145中，IL-6/JAK2/STAT3的激活能顯著增強(qiáng)DU145細(xì)胞的抗凋亡能力，使用花姜酮處理后DU145細(xì)胞后，IL-6/JAK2/STAT3信號途徑被顯著抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[23]。此外，在肺癌中，STAT3高表達(dá)與抗凋亡作用相關(guān)，如葛根素抑制STAT3后，A549細(xì)胞凋亡顯著增加[24]。同樣，在前列腺癌中STAT3也與抗凋亡作用相關(guān)[25-26]。更為重要的是，在肝癌中下調(diào)IL-6的表達(dá)能抑制STAT3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞LM3的凋亡[27]。此外，有研究報(bào)道，在結(jié)腸癌的小鼠模型中，BBR能夠抑制IL-6的表達(dá)，從而改變小鼠結(jié)腸癌的惡性病變狀態(tài)[28]。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，BBR通過抑制JAK2/STAT3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[29]。同樣的，在人慢性髓系白血病細(xì)胞K562中，BBR也能抑制JAK2/STAT3的表達(dá)，從而抑制K562細(xì)胞的凋亡[30]。與預(yù)期一致，在本研究中，BBR能夠誘導(dǎo)DU145R細(xì)胞凋亡，而且還能夠抑制DU145R細(xì)胞IL-6及STAT3的mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。

綜上所述，BBR可通過下調(diào)IL-6/STAT3的表達(dá)來誘導(dǎo)DU145R細(xì)胞的凋亡。本研究未進(jìn)行體外驗(yàn)證，沒有進(jìn)一步探討B(tài)BR是否能增加DU145R細(xì)胞對PTX的敏感性，因此在后續(xù)工作中將繼續(xù)驗(yàn)證本研究的假設(shè)。