吳昌學(xué), 李毅, 張婷, 彭煜暉, 張健, 禹文峰, 柏華, 張啟芳**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 都勻 558000)

前列腺癌是男性最常見(jiàn)的腫瘤之一，也是男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，藥物治療仍然是控制前列腺癌的首要方法[1]。但有20%～30%的前列腺癌患者在確診后3年內(nèi)會(huì)發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer CRPC)，大部分CRPC患者在治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥的情況，給臨床治療帶來(lái)困擾[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種從紅豆杉樹(shù)皮分離提純、具有抗癌活性的類化合物[4-5]，可誘導(dǎo)與促進(jìn)微管蛋白聚合和裝配、防止解聚，從而使微管穩(wěn)定，并抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和觸發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而有效阻止癌細(xì)胞的增殖[6]。除肉瘤、淋巴瘤和白血病外，PTX還用于胃食管癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、晚期宮頸癌及前列腺癌的治療[7-11]，亦是治療CRPC患者的標(biāo)準(zhǔn)抗癌藥物之一，但在治療過(guò)程中患者會(huì)發(fā)生獲得性耐藥[12]。因此，闡明人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株細(xì)胞對(duì)PTX耐藥的分子機(jī)制，對(duì)于CRPC患者新的治療策略研發(fā)至關(guān)重要。因此本研究以人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株DU145細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)PTX濃度遞增的方法處理DU145細(xì)胞、建立人耐PTX去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞系，然后使用低于最高處理濃度的PTX培養(yǎng)基保持細(xì)胞株的活性，為后續(xù)研究提供人耐PTX去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株DU145細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)。

1.1.2主要試劑和儀器 PTX和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國(guó) Sigma)，Trizol(美國(guó)Invitrogen)，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa )，HiffTMq PCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒(上海翊圣)，兔抗多耐藥基因1(multiple drug resistant gene 1, MDR1)抗體、兔抗β-Tubulin抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(美國(guó)CST)，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白Marker(美國(guó)Thermo)，超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國(guó) Millipore)，ELX800UV 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tec)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) DU145細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。

1.2.2人耐PTX前列腺癌細(xì)胞株DU145R的構(gòu)建及細(xì)胞核觀察 采用濃度遞增的方法(以1、4、6、8、10、及12 nmol/L的PTX)處理DU145細(xì)胞(處理過(guò)程中確保DU145細(xì)胞不會(huì)死亡)，12 nmol/L濃度處理后存活的DU145細(xì)胞作為PTX耐藥細(xì)胞株(命名為DU145R，此后以10 nmol/L的PTX維持培養(yǎng))，收集DU145R細(xì)胞，均分為4份，一份用于檢測(cè)細(xì)胞活性，一份在100×顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，另外2份用于人MDR1和c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。以正常培養(yǎng)的DU145細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.3細(xì)胞活性檢測(cè) 采用細(xì)胞增殖檢測(cè)(cell counting kit-8,CCK8)法檢測(cè)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145、 DU145R細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔，接種于96孔板中。使用0.25 μmol/L PTX處理 72 h，按照說(shuō)明，使用CCK8試劑盒檢測(cè)450 nm處的吸光度(optical density，OD)值，評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.4MDR1和c-MycmRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按cDNA 逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)。qPCR 引物由武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司合成，MDR1上游引物為5′-GCAGCTGGAAGACAAATACACAAA-3′，下游引物為5′-CCCCAACATCGTGCACATC-3′。c-Myc基因上游引物為5′- TACCCTCTCAACGACAGCAG-3′， 下游引物為5′- TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3′。內(nèi)參照次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因上游引物為5′-CATTATGCTGAGGATTTGGAAAGG-3′， 下游引物為5′-CTTGAGCACACAGAGGGCTACA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、 60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采集目的基因CT值，以內(nèi)參照HPRT作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MDR1和c-Myc基因相對(duì)表達(dá)量(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.5MDR1 和c-Myc蛋白表達(dá)水平 采用Wes-tern blot法檢測(cè)，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，常規(guī)一抗和二抗孵育后，ECL超敏免疫印跡檢測(cè)試劑 (Amersham公司) 檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.6c-MyCmRNA表達(dá)分析 用在線軟件TIMER2.0 (http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)的 Gene_差異表達(dá)模塊分析癌癥基因圖譜( the cancer genome atlas ,TCGA)中所有腫瘤(20多種腫瘤數(shù)據(jù), 包括患者的臨床預(yù)后資料)，分析c-Myc基因在腫瘤與鄰近正常組織間的表達(dá)差異，其中包括前列腺癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DU145R細(xì)胞核變化

按照1、4、6、8、10、及12 nmol/L的PTX濃度處理DU145細(xì)胞后獲得DU145R細(xì)胞，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常培養(yǎng)的DU145細(xì)胞比較，耐藥DU145R細(xì)胞出現(xiàn)多核化。見(jiàn)圖1。

DU145 DU145R注：白色箭頭所示為多核化。

2.2 DU145細(xì)胞與耐藥DU145R細(xì)胞的活性

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，DU145細(xì)胞和DU145R細(xì)胞分別加入 0.25 μmol/L PTX處理 72 h后，DU145細(xì)胞活力(17.3%)低于DU145R細(xì)胞活力(79.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 見(jiàn)圖2。

注：(1)與DU145細(xì)胞比較， P<0.01。

2.3 耐藥細(xì)胞DU145R中MDR1表達(dá)

MDR1是許多腫瘤細(xì)胞耐藥的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示， DU145R細(xì)胞的MDR1 mRNA 表達(dá)水平較DU145細(xì)胞上調(diào)了82.3倍，與DU145細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； MDR1蛋白在DU145細(xì)胞的表達(dá)很低，在DU145R細(xì)胞的表達(dá)水平也被上調(diào)。見(jiàn)圖3。

注：A為 MDR1 mRNA 表達(dá)，B為MDR1 蛋白表達(dá)；(1)與DU145細(xì)胞比較，P<0.001。

2.4 耐藥細(xì)胞DU145R中c-Myc表達(dá)

研究結(jié)果顯示， DU145R細(xì)胞的c-Myc mRNA 和蛋白表達(dá)水平較DU145細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在線軟件TIMER2.0分析發(fā)現(xiàn)， 與鄰近正常組織比較，c-MycmRNA在多種腫瘤組織均有表達(dá)，但其表達(dá)水平有升高也有降低(P<0.05)；在前列腺癌組織，c-MycmRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注： A為c-Myc mRNA 定量表達(dá)，B為c-Myc 蛋白表達(dá)及定量結(jié)果，C為 c-Myc在多種正常和腫瘤組織的mRNA表達(dá)，紅色表示腫瘤組織， 蘭色表示正常組織；紅色方框線內(nèi)為前列腺癌組織與前列腺組織c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)量； (1)與DU145細(xì)胞比較，P<0.001；與正常組織比較， (2)P<0.001，(3)P<0.05，(4)P<0.01。

3 討論

運(yùn)用PTX進(jìn)行藥物治療能提高CRPC病人的生存率，是目前治療CRPC患者的主要藥物[12]。雖然治療初期效果良好，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)PTX耐藥，影響了PTX的療效，減少了CRPC患者治療選擇[13]。用化療藥誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞，比較接近腫瘤患者腫瘤耐藥細(xì)胞的表型[14]， 這也是目前細(xì)胞水平研究腫瘤細(xì)胞耐藥分子機(jī)制的主要手段[14]。使用PTX誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞系是在體外單純環(huán)境下誘導(dǎo)的，沒(méi)有腫瘤微環(huán)境的影響，耐藥細(xì)胞系不可能完全與腫瘤病人腫瘤耐藥細(xì)胞的表型一致；其次，從腫瘤病人獲取腫瘤耐藥細(xì)胞的前提是病人只使用了一種藥物，產(chǎn)生了耐藥，這種耐藥細(xì)胞非常難得[14]。除此之外，相同腫瘤的病人對(duì)相同藥物耐藥的細(xì)胞表型也不完全一致。

研究表明耐藥細(xì)胞多核化是耐藥細(xì)胞的變化之一，多核多倍體促進(jìn)人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株細(xì)胞PC3多西他賽的耐藥性[15]；卡巴他賽處理導(dǎo)致人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞多核化增強(qiáng)了卡巴他賽的抗性[15]。這些研究支持本研究的結(jié)果，建立的DU145R細(xì)胞出現(xiàn)多核化。PTX通過(guò)作用腫瘤細(xì)胞微管起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)期的PTX刺激，出現(xiàn)多核多倍體，引起細(xì)胞增大，暗示PTX改變細(xì)胞核的功能，將在后續(xù)工作中研究PTX對(duì)細(xì)胞核的作用。

此外，細(xì)胞活力(生長(zhǎng)曲線)的測(cè)定結(jié)果表明在PTX處理后DU145R細(xì)胞活性明顯高于DU145細(xì)胞活性，說(shuō)明DU145R細(xì)胞比DU145細(xì)胞對(duì)PTX敏感性降低，具有抵抗性。人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞PTX耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜，其中MDR1 上調(diào)是其中之一。MDR1是ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一[16]，是ATP依賴性藥物外排泵, 即MDR1把藥物運(yùn)到細(xì)胞外，阻止了藥物對(duì)細(xì)胞發(fā)揮作用。MDR1表達(dá)上調(diào)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥(multi-drug resistance, MDR)的重要機(jī)制之一。 MDR1的表達(dá)在PTX耐藥的人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3被上調(diào)； 在多西他賽前列腺癌被上調(diào)；在卵巢癌細(xì)胞MDR1表達(dá)促進(jìn)了PTX和奧拉帕尼耐藥[17-19]。與前人研究結(jié)果相似， 與DU145相比，MDR1在本研究建立的DU145R細(xì)胞的表達(dá)在mRNA和蛋白水平被上調(diào)，說(shuō)明DU145R細(xì)胞具有耐藥性。

除此之外，越來(lái)越多的證據(jù)表明c-Myc是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥的主要原因之一，如持續(xù)誘導(dǎo)c-Myc表達(dá)有助于胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中的nab-PTX耐藥性，抑制 c-Myc可以減輕前列腺癌中的恩雜魯胺(enzalutamide)耐藥性，降低急性白血病對(duì)BET抑制劑的耐藥[20-22]。c-Myc 協(xié)調(diào)髓細(xì)胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)共同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥， 維持c-Myc表達(dá)促進(jìn)人源去勢(shì)性前列腺癌細(xì)胞對(duì)BET bromodomain 抑制劑的獲得性耐藥，沉默c-Myc表達(dá)可以增強(qiáng)CRPC細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性[23-25]。這些研究支持本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，c-Myc在DU145R細(xì)胞表達(dá)明顯高于DU145細(xì)胞。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)成功建立了耐PTX前列腺癌細(xì)胞系，為后續(xù)研究提供了PTX CRPC細(xì)胞耐藥模型。