崔 陽

（河北醫(yī)科大學附屬燕達醫(yī)院神經(jīng)外科，廊坊 065201）

癲癇發(fā)病后往往會使患者出現(xiàn)不同程度的腦功能異常[1-2]。根據(jù)最新WHO 數(shù)據(jù)顯示[3]，癲癇患病率為3.5%～4.8%。因此，對于癲癇病的病因以及特異性藥物的開發(fā)或臨床治療手段的尋找至關(guān)重要。研究表明機體免疫系統(tǒng)功能的異常與癲癇的發(fā)病原因存在一定的相關(guān)性[4]。關(guān)于癲癇發(fā)病機制的假說主要集中于離子通道或神經(jīng)信號通路等[5-6]。研究顯示機體免疫系統(tǒng)是癲癇的發(fā)病基礎(chǔ)，并顯示大量的細胞因子如白介素家族蛋白或某些炎性分子在癲癇發(fā)病過程中擔任極其重要的角色，其中對白細胞介素（interleukin，IL）1β（IL-1β）、IL-2、IL-8 的研究相對較為豐富。炎性因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）也共同參與了癲癇的形成，并與神經(jīng)系統(tǒng)的異常變化密切相關(guān)。凋亡蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其基因控制著海馬神經(jīng)元的正?；蛉毕?，因此凋亡蛋白的上調(diào)或下調(diào)也控制著癲癇的發(fā)生和發(fā)展[7]。高壓氧治療能明顯改善組織缺血缺氧，改善炎性反應(yīng)，降低對組織的免疫損傷，保護神經(jīng)功能的作用。因此本研究旨在通過探討高壓氧對癲癇神經(jīng)免疫的影響，為高壓氧對癲癇的治療提供部分理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選擇8 ～10 周齡的健康雄性SD 大鼠36只，體質(zhì)量為180 ～220 g，實驗動物購于北京維通利華實驗動物中心。

1.2 試劑和儀器

氯化鋰、匹羅卡品、水合氯醛、ELISA 試劑盒購自江蘇寶萊生物科技有限公司；RIPA 細胞/組織裂解液購自上海生工有限公司；4%多聚甲醛、蔗糖、YLC 0.5/0.8 型高壓氧艙購自上海701 所；Statfax 4200 型酶標儀購自美國AWARENESS 公司；Microfuge 20R 型冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司；DMI3000B 型熒光顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.3 實驗分組與癲癇模型制備

采用隨機數(shù)字法將36 只SD 大鼠進行編號，1 ～12 號實驗動物設(shè)置為空白對照組，剩余24 只動物接受匹羅卡品法建立癲癇模型[8]，建模過程如下：腹腔注射氯化鋰溶液 （125 mg/kg），18 h 或20 h 后再腹腔注射30 mg/kg 匹羅卡品溶液，30 min后，根據(jù)Racine 評分標準對大鼠行為評價，如評價等級達到4 或5 級則認為達到癲癇標準，如無癲癇發(fā)作或未達到4 或5 級則再次注射匹羅卡品，直至達到癲癇標準，最多注射次數(shù)為4 次。將24 只癲癇建模成功的動物隨機分為2 組，分別為模型組和干預(yù)組，每組12 只。

1.4 治療方法

對干預(yù)組動物進行高壓氧治療干預(yù)，具體操作如下：首先對高壓氧艙各項參數(shù)進行設(shè)定，將氧艙內(nèi)設(shè)置為高氧氣濃度（80%～90%），每日進行1 次治療，30 min，7 d 1 個療程，每只實驗動物均接受21 次高壓氧治療。每個療程治療后，停止3 d，以防動物在治療期間出現(xiàn)氧氣中毒或減壓疾病[9]。

1.5 標本采集與處理

高壓氧治療后將全部動物行腹腔注射10%的水合氯醛實施麻醉以采集標本。將實驗動物四肢固定于解剖板，用剪刀小心剪開腹腔，利用導(dǎo)管負壓狀態(tài)下抽取下腔靜脈血3 ～5 mL，3 000 ～3 500 r/min 冷凍離心20 min，收集血清并于-20℃貯存。采用ELISA 法對實驗動物血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 水平進行測定。將動物頸椎脫臼法處死，快速取海馬組織，部分海馬組織進行勻漿，并用RIPA 細胞/組織裂解液裂解，貯存于-80℃，用于免疫印跡檢測。剩余部分海馬組織用PBS 洗滌后進行4%多聚甲醛固定，濃度為30%的蔗糖溶液脫水，待組織下沉后可進行中性樹脂包埋，冷凍切片機制作超薄切片后貯存于-80℃，用于免疫熒光染色檢測[10-11]。

1.6 ELISA 檢測

參照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 的表達量。

1.7 免疫印跡檢測[12]

在癲癇發(fā)作后不同時間點分別斷頭取血，分離血清。同時取腦，迅速剝離海馬，勻漿，取上清，將血清和勻漿液置于-70℃待測。RIPA 細胞/組織裂解液后的海馬組織樣品與等體積的2×上樣緩沖液，混勻后100℃煮樣10 ～15 min，待SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。首先配制12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠對總蛋白進行分離，濃縮膠電壓設(shè)置為70 ～80 V，待電泳至分離膠時可調(diào)節(jié)電壓至120 ～130 V，根據(jù)蛋白Marker 條帶顯示至凝膠底部時停止電泳。電泳結(jié)束后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜參數(shù)設(shè)置為恒定電流300 mA，時間80 ～90 min，總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后利用5%的脫脂牛奶封閉非特異性抗原2 h，根據(jù)Marker 條帶蛋白大小顯示針對Bax、Bcl-2 蛋白進行鼠抗或兔抗過夜孵育，PBST 洗滌PVDF 膜3 次，每次5 ～10 min 即可，然后進行HRP 標記的羊抗鼠或羊抗兔抗體進行二抗孵育，室溫1 ～2 h 即可進行ECL 發(fā)光檢測，所得條帶使用Image J 軟件定量或分析。

1.8 免疫熒光染色檢測[13]

將制備的冷凍切片取出，PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，為消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性加入0.3%過氧化氫，再次PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，然后利用濃度為5%的牛血清白蛋白孵育2 h 以封閉非特異性抗原，封閉后無需PBS 漂洗可直接進行Bax 和Bcl-2 鼠抗或兔抗孵育，4℃，24 h，PBS 漂洗3 次，每次漂洗3 ～5 min，使用帶有熒光標記的羊抗鼠或羊抗兔HRP室溫孵育1 ～2 h，即可于熒光顯微鏡下進行拍照觀察。利用Image J軟件分析陽性細胞數(shù)目，總細胞數(shù)至少觀察200個，每組重復(fù)3次，取平均值比較。

1.9 統(tǒng)計學處理

本研究采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 處理數(shù)據(jù)，以百分比率（%）表示計數(shù)資料，行χ2檢驗；以±s表示計量資料，行t檢驗，當P＜0.05 時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高壓氧治療對癲癇大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表達的影響

與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表達水平均顯著升高，IL-2表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，與癲癇模型組相比，實驗大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表達水平顯著降低，IL-2表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，癲癇病的發(fā)生發(fā)展與白介素家族基因表達水平具有一定相關(guān)性（圖1）。

圖1 高壓氧治療對癲癇大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表達的影響

2.2 各組海馬神經(jīng)元Bax 和Bcl-2 的表達變化

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，空白對照組SD 大鼠海馬組織Bax 蛋白光密度值最低，癲癇模型組大鼠海馬神經(jīng)元Bax 蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，Bax 蛋白水平顯著下調(diào)。與空白對照組相比，癲癇模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 在海馬神經(jīng)元中表達顯著下降，經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，該蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。因此，海馬神經(jīng)元凋亡因子的表達預(yù)示癲癇疾病的發(fā)作過程（圖2）。

圖2 免疫印跡檢測Bax 和Bcl-2 光密度的定量結(jié)果

2.3 海馬神經(jīng)元Bax 和Bcl-2 的相對變化情況

免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠神經(jīng)元Bax 陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著升高，而Bcl-2 陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，Bax 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯降低，而Bcl-2 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，該結(jié)果也進一步證明了海馬神經(jīng)元Bax 和Bcl-2 的相對變化與癲癇具有相關(guān)性（圖3）。

圖3 免疫熒光檢測Bax（A1～C1）和Bcl-2（A2～C2）陽性神經(jīng)元數(shù)

3 討論

IL-1β 是一種細胞調(diào)節(jié)因子，屬于白介素-1 家族成員之一，許多免疫系統(tǒng)異常疾病均與該調(diào)節(jié)因子的異常表達或分泌相關(guān)[14-15]。根據(jù)最新研究表明，與正常人群相比，癲癇患者外周血血清中IL-1β 的表達水平明顯升高，同時該調(diào)節(jié)因子的表達水平甚至可以對神經(jīng)元受損程度提供一定的參考依據(jù)。IL-1β 在癲癇患者中顯著升高主要原因之一為該因子可在體內(nèi)刺激分泌細胞分泌，并釋放其他炎性因子，以促進癲癇的發(fā)生發(fā)展。IL-2 是機體在受到外界應(yīng)激時產(chǎn)生的糖蛋白，能夠刺激并促進T 細胞生長，因此該細胞調(diào)節(jié)因子的主要功能為調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)以應(yīng)對不良外界條件[16-17]。癲癇患者血清中IL-2 水平與正常人相比明顯較高，因此大量國內(nèi)外研究證實該調(diào)節(jié)因子通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)參與癲癇的發(fā)病過程。IL-8、TNF-α 是2 種機體分泌的炎性因子，能夠?qū)е戮植拷M織的炎癥反應(yīng)，目前關(guān)于兩者與癲癇之間關(guān)系的研究還相對較少[18]。近年來隨著對癲癇深入研究表明，該疾病發(fā)病過程中具有細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡因子的上調(diào)或下調(diào)最終引起海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生程序性死亡。Bax 和Bcl-2 分別為促凋亡基因和抗凋亡基因，因此該對基因的相對表達可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，并參與癲癇的發(fā)病過程[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表達水平均顯著升高，IL-2 表達水平明顯降低，經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，與癲癇模型組相比，大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表達水平顯著降低，IL-2 表達水平明顯升高，表明癲癇的發(fā)生發(fā)展與白介素家族基因表達水平具有一定相關(guān)性。與空白對照組相比，癲癇模型組促凋亡蛋白Bax 表達顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著下降，經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，Bax 蛋白水平顯著下調(diào)而Bcl-2 蛋白水平顯著上調(diào)。因此，海馬神經(jīng)元凋亡因子的表達調(diào)控癲癇疾病的發(fā)作過程。免疫熒光染色對海馬神經(jīng)元凋亡因子Bax 和Bcl-2 的陽性神經(jīng)元數(shù)量評估顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠神經(jīng)元Bax 陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著升高，而 Bcl-2 陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著降低，經(jīng)過高壓氧治療干預(yù)后，Bax 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯降低，而 Bcl-2 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，該結(jié)果也進一步證明了海馬神經(jīng)元凋亡基因Bax 和Bcl-2 的相對變化與癲癇具有相關(guān)性。