李素文 劉曉清 向 慧

（長沙市第三醫(yī)院腎內(nèi)科，長沙 410000）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是由 多種疾病導致的腎功能下降的臨床常見病，如不及時治療，容易發(fā)展為慢性腎病，甚至導致終末期腎病出現(xiàn)[1]。缺血再灌注是急性腎損傷最常見病因[2]。腎處于缺氧缺血條件時，腎細胞處于敏感時期，腎小管會分泌大量炎癥因子，導致多種凋亡信號通路出現(xiàn)，誘發(fā)腎小管上皮細胞出現(xiàn)大數(shù)量凋亡[3-4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是各種肥大刺激因子中胞內(nèi)信號轉導的通用路徑，而MAPKAPK-2 屬于此信號通路相關直接底物，其活性增強，并激活下游一系列因子，影響細胞周期、凋亡，調(diào)控血管新生[5-6]。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的多功能營養(yǎng)因子，亦發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)效用，同時作為神經(jīng)保護因子存在[7]。以往研究表明EPO 可抑制腎小管上皮細胞凋亡，但EPO 對腎小管細胞凋亡的作用機制及對MAPKAPK-2 表達的影響尚不明確。本研究旨在探討EPO 對急性腎損傷大鼠腎小管細胞凋亡和MAPKAPK-2 水平的影響。

1 材料和方法

1.1 動物和主要試劑

30 只SD 雄性大鼠（長沙天勤生物公司），體質(zhì)量（225.00±11.07）g，16～17周齡。TRIzol 試劑（浙江AMEKO 公司），逆轉錄試劑盒（武漢賽維爾公司），RT-PCR 試劑盒（上海優(yōu)予公司）。

1.2 分組

30 只大鼠隨機分為假手術組、模型組和EPO治療組，每組10 只。3 組大鼠均經(jīng)10%苯巴比妥鈉麻醉后開腹，模型組、EPO 治療組大鼠常規(guī)脫毛、消毒后，分離右腎蒂及輸尿管，采用1 號絲線結扎腎蒂和右輸尿管，繼續(xù)分離左腎，采用無創(chuàng)傷性夾鉗閉合腎動脈35 min，后采用生理鹽水腹腔灌注，逐層關閉腹腔，建立急性腎損傷大鼠模型。假手術組打開腹腔，并進行左右兩腎分離腎被膜，逐層關閉腹腔。EPO 治療組腹腔注射EPO 50 U/kg，每周3 次，共計6 周。

1.3 腎功能指標檢測

6 周后采集大鼠下腔靜脈血 5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，ELISA 法測定血清大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素（urea），腎損傷分子（kidney injury molecule 1，KIM-1）水平。所有步驟嚴格按照說明書操作。

1.4 H-E 染色觀察腎組織病理變化

假手術組、模型組、EPO 治療組大鼠實驗結束后，腹腔注射麻醉斷頭處死大鼠，分離腎組織標本，甲醛固定60 min，常規(guī)石蠟包理制片，片厚4 μm，采用蘇木精和伊紅染色液復染分別為6 ～ 8 min 和10 s，選取染色清晰切片，放在高倍鏡下（×400）觀察腎組織病理學改變，并拍照。結果由病理科醫(yī)師采用單盲法觀察腎組織的病理損傷變化（腎小球體積、毛細血管基底膜厚度和腎小管上皮細胞空泡等）。病理評估標準參考文獻[6]。

1.5 RT-PCR 法檢測腎組織MAPKAPK-2 水平變化

將胰蛋白酶加入大鼠腎組織中進行消化反應，進行PBS沖洗，然后滴入0.9%NaCl溶液，總RNA采用TRIzol法來提取，總RNA提取反轉錄成 cDNA，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對p-MAPKAPK-2表達水平進行檢測，p-MAPKAPK-2上游引物序列：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；內(nèi)參采用β-actin。PCR反應條件：60 ℃，10 min、95 ℃、72℃，各 30 s、95℃，5 min，40個循環(huán)，實驗次數(shù)至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算p-MAPKAPK-2表達。

1.6 免疫印跡檢測腎組織p-MAPKAPK-2 蛋白表達

腎組織加入蛋白裂解液，離心，后將取得溶液加入樣孔。電泳后，取下PVDF 膜TBS 浸泡10 min，密封，PBS 反復沖洗，然后加一抗（1：500），40℃雜交1 d，重復上述清洗步驟，加入二抗（1：2 000），雜交2 h。將膜浸入ECL 工作液，隨后進行檢測，獲取電泳圖像。

1.7 流式細胞術檢測腎小管細胞凋亡情況

取大鼠腎組織，并剪碎，PBS 清洗后收集清洗液80 目篩網(wǎng)過濾，再用PBS 洗滌離心重懸，純化腎小管節(jié)段，并接種于培養(yǎng)皿中，收集從腎小管節(jié)段中爬出的細胞，對其進行洗滌2 次，離心5 min，選擇100 μL 的1×結合緩沖液，進行重懸細胞操作，用5 μL 標記FITC 的Annexin Ⅴ與5 μL PI 染色混勻，避光孵育15 min 后加入與400 μL 結合緩沖液混勻，洗滌3 次對腎小管細胞情況進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用χ2或t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能指標

與假手術組比較，模型組大鼠腎功能出現(xiàn)明顯下降，血Scr、尿素、KIM-1 值增加。與模型組比較，EPO 治療組大鼠血Scr、Urea、KIM-1 值下降，腎功能有所好轉（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠腎功能指標比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠腎功能指標比較（n=10，±s）

*P＜0.05 vs 假手術組；#P＜0.05 vs 模型組

組別 Scr（μmol/L） 尿素（mmol/L） KIM-1（μg/L）假手術組 47.85±4.98 8.12±2.78 1.13±0.13模型組 106.51±14.51* 20.64±5.25* 2.45±0.32*EPO 治療組 70.11±7.35*# 13.27±3.51*# 1.72±0.20*#

2.2 各組大鼠腎組織病理變化比較

假手術組腎結構完整清晰，腎組織未見水腫、炎癥細胞浸潤。模型組腎組織明顯水腫，炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)見散在出血點及多量炎癥細胞浸潤。EPO 治療組腎組織損傷情況有所改善，腎小管周圍組織炎癥浸潤較模型組減輕（圖1）。

圖1 各組大鼠腎組織結構變化比較，H-E 染色，×200

2.3 各組大鼠腎組織p-MAPKAPK-2 mRNA 表達

假手術組、模型組和EPO治療組腎組織p-MAPKAPK-2 mRNA表達量分別為0.32±0.05、0.78±0.07及0.55±0.06，模型組大鼠較假手術組p-MAPKAPK-2 mRNA表達升高，EPO治療組較模型組p-MAPKAPK-2 mRNA表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腎組織中p-MAPKAPK-2 蛋白表達

假手術組、模型組和EPO治療組腎組織p-MAPKAPK-2蛋白表達分別為0.42±0.07、0.81±0.10及0.53±0.04，模型組大鼠較假手術組p-MAPKAPK-2蛋白表達顯著升高，EPO治療組較模型組p-MAPKAPK-2蛋白表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腎組織p-MAPKAPK-2 蛋白表達

2.5 各組大鼠腎小管細胞凋亡比較

假手術組、模型組和EPO 治療組大鼠腎小管細胞凋亡率分別為5.68%±0.23%、19.62%±1.20%及13.02%±0.80%，模型組大鼠較假手術組腎小管細胞凋亡率增加，EPO 治療組較模型組腎小管細胞凋亡率下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。其中，模型組大鼠腎小管細胞凋亡率最高，EPO 治療組其次，假手術組最低。

圖3 各組大鼠腎小管細胞凋亡情況比較

3 討論

急性腎損傷治療和預防是臨床工作者關注的重點，由于患者致病因素較多，主要原因包含感染、腎毒性藥物及缺血再灌注等，其中缺血再灌注是誘發(fā)該疾病產(chǎn)生最常見的病因[8]。有研究表明急性腎損傷病因與腎血流量急劇減少有關，腎小管細胞性質(zhì)改變及凋亡，嚴重時會促進多種蛋白因子產(chǎn)生，堵塞腎小管[9-10]。而EPO對于急性腎損傷引起的腎小管細胞凋亡有抑制作用，臨床應用較廣范[11]。而MAPK信號對急性腎損傷發(fā)生、發(fā)展有重要作用，研究者深入研究，證實PI3K/AKT信號可促進炎癥因子的分泌，使腎小管細胞凋亡，導致病情向不可控方向發(fā)展[12-13]。而p-MAPKAPK-2屬于MAPK作用底物之一，其水平升高可使腎小管細胞凋亡，導致病情向無法挽救方向發(fā)展[14]。

腎組織生長發(fā)育過程中，EPO 可對腎組織發(fā)揮保護作用，其作用在于EPO 會增強腎組織受損區(qū)域新生血管的能力，改善腎功能，加快損傷區(qū)域細胞、組織功能恢復[15]。急性腎損傷大鼠組織中p-MAPKAPK-2 活性升高，腎組織細胞功能受p-MAPKAPK-2 活性的影響，腎功能受到嚴重損傷，通過干預手段抑制其活性后，病情能得到明顯改善[16]。有研究者證實，EPO 在多個細胞自我維持和增殖、分化的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，EPO與其配體結合后可避免組織細胞的凋亡，在進入機體組織后激活相關信號通路，促進細胞功能恢復，且對腎功能也有明顯改善作用[17-18]。本研究結果顯示，模型組大鼠腎功能出現(xiàn)明顯下降，EPO治療組大鼠腎功能有所好轉，說明采用EPO 干預后急性腎損傷大鼠腎功能改善，腎組織炎癥浸潤降低，和上述研究結果相符。有文獻報道，急性腎損傷患者p-MAPKAPK-2 表達呈升高趨勢，如保持p-MAPKAPK-2 表達處于抑制狀態(tài)，患者疾病進展也會得到明顯抑制[19-20]。有研究證實，在腎缺血再灌注大鼠腎組織中p-MAPKAPK-2 水平呈升高趨勢，會使腎損傷狀態(tài)加重[21]，而另一項研究表明EPO 對急性腎損傷大鼠的改善作用是通過激活MAPK 來實現(xiàn)，MAPKAPK-2 是MAPK 通路的重要作用底物，可對多個細胞凋亡起調(diào)控作用[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠p-MAPKAPK-2 水平升高明顯，EPO 治療組大鼠p-MAPKAPK-2 水平有所下降，腎上皮細胞凋亡改善。說明采用EPO 干預后急性腎損傷大鼠改善腎組織上皮細胞凋亡，其機制與抑制MAPKAPK-2 信號通路相關。