谷慧凝 韓銀河 張明正 李 彬 溫 昱△

（中國醫(yī)科大學，1 基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，2 附屬盛京醫(yī)院關節(jié)外科與運動醫(yī)學科，沈陽 110122）

前交叉韌帶損傷引起復發(fā)性膝關節(jié)不穩(wěn)定，導致半月板撕裂、關節(jié)軟骨退變等其他膝關節(jié)結(jié)構繼發(fā)性損傷[1]。由于前交叉韌帶損傷后的自愈能力非常差，目前手術修復仍為其主要治療手段，但術后的前交叉韌帶仍不能較好地恢復其生物學功能，甚至會出現(xiàn)關節(jié)僵硬、骨關節(jié)炎等術后并發(fā)癥，而內(nèi)側(cè)副韌帶有相對更好的自愈能力，在某些情況下可以自我愈合，并完全恢復其功能[2-3]。自噬是存在于真核細胞中由溶酶體介導的對細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器進行降解和回收的過程，對維持細胞的存活和穩(wěn)態(tài)有重要作用。研究表明，自噬可通過直接或間接方式參與組織損傷修復，在血管新生、傷口愈合、促進表皮和真皮再生等過程中具有重要作用[4-5]，但目前自噬在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后的表達尚未可知，自噬是否可以作為兩者愈合能力差異的可能解釋也沒有詳細探討。因此，本實驗擬通過建立兔前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶部分損傷模型，觀察損傷后不同時間點兩者之間自噬的表達差異，以探索前交叉韌帶損傷后內(nèi)源性修復障礙可能的分子機制，為進一步探索促進前交叉韌帶損傷內(nèi)源性修復的有效手段提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和損傷模型建立、分組和取材

3月齡健康雄性新西蘭大白兔18 只，體質(zhì)量（2 500±200） g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。實驗動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學實驗動物部，室內(nèi)保持光照、黑暗 12 h 晝夜節(jié)律，室溫 22 ℃± 1℃，相對濕度 50% ～60%，自由飲食飲水。適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機選取3 只作為對照組，不作處理。其余15 只兔制備隨機分為5 組 （n=3），由耳緣靜脈注射3%（1 mL/kg）戊巴比妥鈉麻醉，固定動物，手術部位剃毛，消毒，鋪無菌孔巾后，取兔膝關節(jié)偏內(nèi)側(cè)行縱向切口，切口長約1.5 cm，逐層切開皮膚、鈍性分離皮下組織及關節(jié)囊，充分暴露前交叉韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶，用20 mL 針頭在前交叉韌帶近股骨端扎孔，接著同樣在內(nèi)側(cè)副韌帶近股骨端1/3 處刺破韌帶，制造損傷后縫合包扎。兔雙側(cè)前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶均制造損傷。術后肌肉注射頭孢曲松鈉注射液抗感染。韌帶的穿刺均由1 人操作，以保證穿刺力度、損傷部位及程度的一致性。各組分別在造模后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周取材。取材前，將兔經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖并分離兔前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，將其放在干凈的濾紙上均分為 3 份，一份置 2.5%戊二醛中固定，待做透射電鏡檢測； 另一份置 4% 多聚甲醛中固定，以備冰凍切片及H-E 染色；第3 份置于冰上提取蛋白及RNA，以備免疫印跡及 RT-PCR 檢測。

1.2 主要試劑

第一抗體兔多克隆抗體Beclin 1、LC3、p62，第二抗體山羊抗小鼠IgG，山羊抗兔IgG 均購自Proteintech（Chicago，USA）；小鼠單克隆抗體β-actin、抗體稀釋液購自Beyotime（中國上海）；Beclin 1、ATG-5 引物購自Invitrogen （Carlsbad，California，USA）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa Bio。

1.3 H-E 染色觀察前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶組織結(jié)構

將各組經(jīng)4%多聚甲醛固定的前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶取出，PBS 沖洗后制備10 μm 冰凍切片，并進行 H-E 染色。光學顯微鏡下觀察各組兔前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶組織形態(tài)學變化，并用圖像采集系統(tǒng)獲取所需圖片，進行形態(tài)學分析。

1.4 透射電鏡觀察前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶組織結(jié)構

取經(jīng)2.5%戊二醛固定的前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，使用 pH 7.2 的磷酸緩沖鹽溶液漂洗3 次，1%鋨酸固定2 h，4℃下梯度乙醇（50% 、70% 、90%、100%） 脫水； 置換（環(huán)氧丙烷，環(huán)氧丙烷和樹脂 1∶1 混合液，環(huán)氧丙烷和樹脂1∶4 混合液，純樹脂）； 環(huán)氧樹脂包埋后制作半薄切片；超薄切片機切片后銅網(wǎng)撈片，3% 醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色法染色。待樣品干燥后，透射電鏡觀察受損韌帶組織超微結(jié)構變化，并進行分析。

1.5 免疫印跡檢測自噬相關蛋白表達水平

取適量兔前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶組織，加入裂解液勻漿，離心取上清，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，在一定量上清液中加入緩沖液后100℃金屬浴5 min，置于冰上待上樣。SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，置搖床上用 5% 脫脂奶粉封閉1 h，TBST 洗膜，輕輕沖洗PVDF 膜，將其置一抗稀釋液中 4℃ 搖床上孵育過夜。次日用 TBST洗膜，加對應的二抗稀釋液置搖床上室溫孵育1 h，用 TBST 洗膜。將 ECL 化學發(fā)光液均勻涂于膜上，置發(fā)光機中曝光顯影成像，以 Image J 軟件分析掃描圖像，以目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為相對蛋白的表達量。

1.6 RT-PCR 檢測自噬相關基因mRNA 表達水平

取適量兔前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶組織，按照1 mL/100 mg加入TRIzol試劑勻漿，依次加氯仿，振蕩，離心取上清；加異丙醇，振蕩，離心棄上清，75% 乙醇洗滌，室溫晾干；加適量DEPC水溶解RNA，并彈勻離心，隨后測定RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系調(diào)整RNA濃度，并計算逆轉(zhuǎn)錄所需上樣量，而后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。 按TB Green Premix Ex TaqⅡ （Tli RNaseH Plus）配置反應混合物后，并進行RT-PCR擴增，反應條件：預變性（95 ℃、30 s）；擴增（95 ℃、5 s，60 ℃、30 s）；溶解曲線（95 ℃、5 s，60 ℃、1 min，95 ℃）；降溫（50 ℃、30 s）。ATG-5正向引物序列5'-TG CTTTCCTCCACTGTCGTC-3'，反向引物序列5'-T CGAGTG-GCACACATTTCCA-3'；Beclin 1 正向引物序5'-CCTCAAGTGGGGTCTTGCTT-3'，反向引物序列5'-AACTGTGACAAGGGTCGGTG-3'；GAPDH正向引物序列5'-GG-GAAGCTGGTCATC AACGG-3'，反向引物序列5'-AACTGT-GACAA GGGTCGG-TG-3'。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司設計并合成。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴增產(chǎn)物的Ct值，采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。每個樣品設置3個復孔，取均值。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)用±s表示,損傷后不同時間點各組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較,各組內(nèi)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶差異以LSD法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后形態(tài)學變化

H-E 染色（圖1，見封二）顯示，正常對照組前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶纖維束呈縱向排列，成纖維細胞形態(tài)規(guī)則呈梭形，分布于韌帶的膠原纖維之間。在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后不同時間點，組織之間開始出現(xiàn)不同程度的腔隙，成纖維細胞及其膠原纖維排列不規(guī)則，且前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶均未出現(xiàn)明顯的愈合趨勢。各組損傷后不同時期細胞內(nèi)均觀察到自噬小體的存在，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）和少量細胞器（圖2，見封二）。

圖1 H-E 染色觀察各組韌帶損傷部位形態(tài)學變化，標尺=300 μm

2.2 前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后自噬相關蛋白Beclin 1、LC3、p62 的表達變化

在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶部分損傷后3 d、1周、2周、4周、6周的過程中，自噬相關蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ與 p62 的表達總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢（圖3）。損傷后3 d，前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶中Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ與 p62 的表達均較正常對照組升高（P＜0.01），并達到峰值，此后逐漸降低。損傷后1 周，前交叉韌帶中Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ與p62 仍高于正常對照組水平（P＜0.01），此時內(nèi)側(cè)副韌帶中各蛋白表達與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義。損傷后2周，前交叉韌帶中Beclin 1、p62的表達恢復至正常水平，LC3-Ⅱ/Ⅰ仍為高表達狀態(tài)（P＜0.01）。損傷后4周，前交叉韌帶中各蛋白表達恢復至正常水平，內(nèi)側(cè)副韌帶中p62表達低于正常對照組（P＜0.05）。損傷后6周，內(nèi)側(cè)副韌帶中各蛋白表達水平明顯低于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01）。此外，損傷后各時間點前交叉韌帶中各蛋白相較于正常對照組的高表達始終比內(nèi)側(cè)副韌帶更為顯著。

圖3 各組自噬相關蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達水平變化

2.3 前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后自噬相關基因ATG-5、Beclin 1 mRNA 表達的變化

在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶部分損傷后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周的過程中，自噬相關基因Beclin 1、ATG-5 mRNA 的表達總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢（圖4）。損傷后3 d 至6 周內(nèi)，與正常對照組相比，前交叉韌帶中Beclin 1、ATG-5 mRNA 始終處于高表達狀態(tài)（P＜0.01），在1 周時達到峰值，且在損傷后3 d、1周、4周、6周4個時間點前交叉韌帶中Beclin 1、ATG-5 mRNA的表達始終高于內(nèi)側(cè)副韌帶；而在內(nèi)側(cè)副韌帶中，Beclin 1、ATG-5 mRNA高表達的峰值出現(xiàn)在2周時，且此時內(nèi)側(cè)副韌帶中的高表達較前交叉韌帶更為顯著（P＜0.01），此后逐漸降低，在損傷后4周、6周2個時間點，Beclin 1、ATG-5 mRNA在內(nèi)側(cè)副韌帶中的表達與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 各組自噬相關基因Beclin 1（A）、ATG-5 mRNA（B）表達水平變化

3 討論

90%的膝關節(jié)韌帶損傷涉及前交叉韌帶或內(nèi)側(cè)副韌帶[6]。但與內(nèi)側(cè)副韌帶相比，前交叉韌帶損傷后的自愈反應極差，手術效果不佳[2-3]，其內(nèi)源性修復障礙已成為現(xiàn)代運動醫(yī)學亟需解決的難題。近年來，學者從血供、干細胞性及成纖維細胞的蛋白表達等方面對此提出了多種解釋[2，6-9]，但仍未闡明具體分子機制。研究表明，自噬可通過直接或間接的方式在血管新生、傷口愈合、促進表皮和真皮再生等過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，自噬的調(diào)節(jié)作為一種組織損傷修復的方法具有相當大的潛力。

本研究結(jié)果顯示，在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周的過程中，自噬的活性隨時間整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，提示自噬可能參與韌帶損傷后修復的過程。自噬的作用具有兩面性，適量的自噬激活對細胞有一定的保護作用，但過多的自噬激活或?qū)е录毎劳鐾緩降募せ頪10]，從而進一步導致細胞的死亡。RT-PCR和免疫印跡檢測結(jié)果顯示，損傷后的前交叉韌帶中自噬的高表達更為顯著，這可能與內(nèi)側(cè)副韌帶擁有更好的血供能力[7]及前交叉韌帶成纖維細胞對炎癥反應更為敏感[11]有關，而這種更強的自噬活性或?qū)е缕湎噍^于內(nèi)側(cè)副韌帶更多的細胞死亡，從而導致其內(nèi)源性修復障礙。相反，內(nèi)側(cè)副韌帶后期表現(xiàn)出的自噬相關蛋白表達的抑制，可能更利于韌帶的修復。此外，本研究結(jié)果顯示，p62 與Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達并未呈現(xiàn)完全相反的變化，可能與自噬小體的累積及自噬通常被阻滯有關[12]。自噬通常由自噬小體形成和自噬降解兩部分組成，自噬降解相關蛋白p62 的累積表明自噬的清除不足，有缺陷或失控的自噬可能通過選擇性降解細胞成分而導致細胞死亡[10]。而前交叉韌帶中更為明顯的p62 累積在某種程度上可能進一步造成了細胞的過度死亡，這或許也導致了前交叉韌帶內(nèi)源性修復障礙。

綜上所述，自噬的表達在前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后存在明顯差異，前交叉韌帶損傷后自噬的過度激活可能導致其內(nèi)源性修復障礙，這為探索前交叉韌帶損傷后內(nèi)源性修復障礙可能的分子機制提供了依據(jù)，也為研究促進前交叉韌帶損傷內(nèi)源性修復的有效手段提供了新思路。