王楨，吳蕊池，莫一嘯，陳靜，湯燕靜，沈樹紅，

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心 血液腫瘤科，上海 200127

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤[1-3]，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。近年來基于危險度分層及危險度調(diào)整的個體化治療方案使得兒童ALL的治療取得了顯著改善，在發(fā)達(dá)國家，總生存率（overall survival rate，OS）達(dá)90%，長期無事件生存率（event-free survival rate，EFS）達(dá)80%[4]。上海兒童醫(yī)學(xué)中心（SCMC）一項(xiàng)研究顯示ALL患兒OS達(dá)80%，長期EFS達(dá)64.6%[5]，但仍有相當(dāng)多的患兒在治療期間經(jīng)歷復(fù)發(fā)、死亡、耐藥、第二腫瘤等。

ALL發(fā)病是多種環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果[6]。近年來全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）表明，胚系單核苷酸多態(tài)性可能影響兒童ALL的易感性，有21個SNP位點(diǎn)和兒童ALL易感性相關(guān)[7-8]。有研究對部分位點(diǎn)進(jìn)行了中國兒童ALL易感性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)位于ARID5B基因的rs10821936和rs10994982與ALL易感性相關(guān)[9-10]。前期本課題組根據(jù)上述基于歐美人群的兩個GWAS報道的兒童ALL易感性位點(diǎn)，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫亞洲人群中風(fēng)險等位基因頻率，就其中12個SNP位點(diǎn)在191例ALL患兒與191例健康志愿者進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601為ALL潛在易感性位點(diǎn)，暫未發(fā)現(xiàn)國外GWAS報道的其他SNP位點(diǎn)與ALL發(fā)病的相關(guān)性[11]。因此，為了排除抽樣誤差，本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量，增加365例病例對這12個SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，研究這些SNP位點(diǎn)與中國兒童ALL易感性的關(guān)系。

白血病療效是腫瘤細(xì)胞、藥物以及機(jī)體之間相互作用的結(jié)果?；诎籽〖?xì)胞生物學(xué)特征的危險度分層（主要是遺傳變異分型）為白血病的精準(zhǔn)治療奠定了基礎(chǔ)。近年來生殖系細(xì)胞的遺傳變異對ALL患兒預(yù)后影響越來越受到關(guān)注。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗白血病藥物的代謝酶GSTM1[12]、DHFR[13]以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC4[14]、ABCB1[15]和兒童ALL預(yù)后有關(guān)。此外，已經(jīng)公認(rèn)ALL細(xì)胞的IKZF1基因突變或缺失和預(yù)后相關(guān)，IKZF1胚系變異是否和兒童ALL預(yù)后有關(guān)同樣值得研究。

1 資料和方法

1.1 樣本量估計(jì) 根據(jù)前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ARID5B基因的rs10821936位點(diǎn)CC基因型在病例組和對照組的頻率分別為0.237和0.112[11]。在α=0.05，1-β=0.08的水平按照病例對照研究樣本量計(jì)算最小樣本量為144例。

1.2 研究對象 包括2009年5月20日至2014年10月28日在SCMC診斷為ALL并嚴(yán)格按照SCMC-ALL-2005方案治療的365例患者，以及2008年至2017年在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院收治的191例ALL患兒和191例健康志愿者[11]，191例健康志愿者均為正常體檢的志愿者，無腫瘤疾病。病例均經(jīng)骨髓涂片的形態(tài)學(xué)評估結(jié)合免疫表型分析、核型分析進(jìn)行診斷。染色體易位，如：t（12；21）（ETV6-RUNX1），t（1；19）（TCF3-PBX1），t（9；22）（q34；q11）（BCR-ABL）和11q23/MLL重排使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)或（和）熒光原位雜交確定。依據(jù)SCMCALL-2005化療方案危險度分級標(biāo)準(zhǔn)將患兒劃分為：低危（LR）、中危（IR）及高危（HR）。最終危險組是根據(jù)治療反應(yīng)和微小殘留?。╩iuimell residual disease，MRD）水平確定的。MRD使用流式細(xì)胞術(shù)確定，靈敏度為0.01%。

1.3 隨訪 所有SCMC診斷的365例ALL患兒自出院之日起開始隨訪。OS定義為從確診至任何原因?qū)е碌乃劳龌蚰┐坞S訪時間。EFS定義為從確診至首個事件發(fā)生或末次隨訪時間。事件定義為復(fù)發(fā)、死亡、耐藥、放棄治療及第二腫瘤。復(fù)發(fā)定義為完全緩解后出現(xiàn)骨髓復(fù)發(fā)（骨髓原始+幼稚細(xì)胞大于25%）和（或）髓外復(fù)發(fā)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)（出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀和體征以及腦脊液中白血病細(xì)胞≥5×106/L） 和睪丸復(fù)發(fā)（病理活檢證實(shí)有白血病細(xì)胞浸潤）。放棄治療被定義為未能完成治愈性治療。失訪定義為完成治愈性治療后失去聯(lián)系。隨訪終點(diǎn)為2019年12 月，隨訪時間為6.8（0.09～10.51）年。

1.4 靶向多重PCR擴(kuò)增子的文庫構(gòu)建與二代測序

1.4.1 文庫構(gòu)建：365例患兒緩解期骨髓凍存細(xì)胞采用德國Qiagen公司的QIAamp?DNA Blood Mini Kit（cat. no.51104）抽提基因組DNA，-20 ℃冰箱保存。取1 μL所提基因組DNA，采用美國Thermo Fisher公司的Qubit?dsDNA HS Assay Kits（cat. no.Q32854）通過Qubit?3.0熒光儀測定基因組DNA濃度。采用iGeneTech?研發(fā)的MultipSeq?CustomPanel（IGMU160V1）試劑盒通過兩步PCR擴(kuò)增方法來完成目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增和建庫。

1.4.2 二代測序和生物信息分析：使用上述試劑盒構(gòu)建出的合格文庫，在美國Illumina公司的NextSeq 6000測序儀上進(jìn)行測序。原始測序數(shù)據(jù)使用Burrows-Wheeler Aligner軟件（BWA v 0.7. 17-r1188）與人類基因組參考序列（hg19）進(jìn)行比對[16]，然后用samtools軟件[17]對比對結(jié)果做單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測分析（篩選條件：比對質(zhì)量＞20，同時測序深度＞500），用ANNOVAR軟件[18]對檢測出的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用率及百分比表示，病例組和對照組基因型分布和等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗(yàn)；Logistic回歸分析所選SNP與ALL風(fēng)險的相關(guān)性；OS、EFS及累積復(fù)發(fā)率采用Kaplan-Meier分析方法進(jìn)行評估，組間差異用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析；預(yù)后因素的影響采用單因素和多因素Cox回歸模型分析；所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床特征 納入研究的556例患兒的臨床特征見表1。

表1 ALL患兒臨床特征（n=556）

2.2 隨訪結(jié)果 截至隨訪終點(diǎn)時間2019年12月，在365例患兒中，中位隨訪時間為6.8（0.1～10.5）年。其中62例（17.0%）患兒復(fù)發(fā)，25例（6.8%）患兒死亡，15例（4.1%）患兒放棄治療，4例（1.1%）患兒失訪，3例（0.8%）患兒轉(zhuǎn)院。

2.3 12個SNP位點(diǎn)與兒童ALL易感性的關(guān)系 對對照組進(jìn)行H-W平衡檢檢，觀察到所有基因型都符合H-W平衡[11]。病例組和對照組中SNP的基因型分布和等位基因頻率及其與兒童ALL易感性的關(guān)系見表2-3。Logistic回歸分析顯示ARID5B基因的rs10821936位點(diǎn)CC基因型、風(fēng)險等位基因C與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（P＜0.05）；rs10994982位點(diǎn)AG基因型、AA基因型、風(fēng)險等位基因A與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（P＜0.05）；位于IKZF1基因的rs11978267位點(diǎn)GA基因型、風(fēng)險等位基因G與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（P＜0.05）；rs4132601位點(diǎn)GT基因型、風(fēng)險等位基因G與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（P＜0.05）；位于ZNF230基因的rs2191566位點(diǎn)CC基因型、風(fēng)險等位基因C與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表2 12個SNP位點(diǎn)與ALL易感性的關(guān)系（n=556）

續(xù)表2

2.4 12個SNP位點(diǎn)與兒童ALL預(yù)后的關(guān)系 在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院收治的191例ALL患兒因病例資料收集不完善未納入該部分分析，所以該部分分析僅包含在SCMC診斷為ALL的365例患兒。通過Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，LOC102723724基因的rs11155133位點(diǎn)AA、AG、GG基因型OS、EFS及累積復(fù)發(fā)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；SIAT7C基因的rs10873876位點(diǎn)CC、TC、TT基因型EFS及累積復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1-2。單因素及多因素Cox回歸分析顯示，LOC102723724基因的rs11155133位點(diǎn)GG基因型及SIAT7C基因的rs10873876位點(diǎn)TC基因型是EFS的不良預(yù)后因素（P＜0.05），同時也是累積復(fù)發(fā)率的不良預(yù)后因素（P＜0.05）。見表4-5。

表4 EFS的單因素和多因素Cox回歸分析（n=365）

圖1 LOC102723724基因的rs11155133位點(diǎn)AA、AG、GG基因型的生存曲線圖（n=365）

圖2 SIAT7C基因的rs10873876位點(diǎn)CC、TC、TT基因型的生存曲線圖（n=365）

3 討論

ALL在兒童和青少年中的癌癥發(fā)病率最高，其病因在很大程度上仍未知[19]。通過對人類基因組的分析，確定了與ALL易感性有關(guān)的21個SNP位 點(diǎn)[7-8]。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大樣本量，對歐美人群易感性相關(guān)的12個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ARID5B基因的rs10821936和rs10994982以及ZNF230基因的rs7554607多態(tài)性位點(diǎn)與我國ALL易感性相關(guān)，IKZF1基因的rs11978267和rs4132601多態(tài)性位點(diǎn)可能與中國ALL易感性相關(guān)，與前期研究結(jié)果一致[11]。在單純擴(kuò)大病例組后，與前期研究結(jié)果比較，我們發(fā)現(xiàn)與ALL易感性相關(guān)及不相關(guān)的位點(diǎn)在中國兒童人群中未發(fā)生任何變化，說明SNP位點(diǎn)確實(shí)具有人群特異性。

在易感性研究中值得一提的是IKZF1基因。早在2009年P(guān)APAEMMANUIL等[7]及TREVI?O等[8]分別報道了IKZF1基因的rs11978267和rs4132601位點(diǎn)與ALL易感性相關(guān)。WANG等[9]對rs4132601位點(diǎn)在中國兒童ALL與健康人群中進(jìn)行了驗(yàn)證，未發(fā)現(xiàn)與中國人群兒童ALL易感性相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)IKZF1基因的rs11978267和rs4132601這兩個位點(diǎn)的雜合基因型及風(fēng)險等位基因與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)，但風(fēng)險等位基因的純合基因型因病例數(shù)少未觀察到與ALL風(fēng)險增加有關(guān)[11]。進(jìn)一步分析rs4132601位點(diǎn)基因型TT、GT、GG及風(fēng)險等位基因G頻率在 PAPAEMMANUIL等[7]、WANG等[9]及我們的病例-對照研究中分布情況，發(fā)現(xiàn)與歐美人群相比，中國人群G等位基因攜帶者（GT、GG）及風(fēng)險等位基因G頻率明顯降低，進(jìn)一步表明SNP位點(diǎn)確實(shí)具有人群特異性。隨后我們將WANG等[9]的研究數(shù)據(jù)和我們的合并，發(fā)現(xiàn)rs4132601位點(diǎn)GT基因型、GG基因型、風(fēng)險等位基因G與ALL風(fēng)險增加顯著相關(guān)（見表3），表明擴(kuò)大樣本后，證實(shí)該位點(diǎn)的確與中國兒童ALL易感性相關(guān)。而rs11978267位點(diǎn)由于缺乏在中國兒童ALL的研究數(shù)據(jù)，不能進(jìn)一步確定該位點(diǎn)與ALL易感性的關(guān)系，后期可擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

表3 rs4132601位點(diǎn)與ALL易感性的關(guān)系（n=1 124）

近年來，兒童ALL的療效有了很大提高，大部分患兒可以用化療治愈。SCMC-ALL-2005研究是我國最早基于MRD監(jiān)測進(jìn)行危險度分層治療的多中心臨床研究隊(duì)列。該研究歷時10年，共入組治療1 085例初診ALL病例，獲得5年EFS（68.3±1.4）%、OS（80.0±1.2）%的療效。在這個研究中充分體現(xiàn)了危險度分層治療的優(yōu)勢，也體現(xiàn)了MRD對與危險度分層的重要性。該研究的單因素分析中35 d MRD對預(yù)后的影響非常顯著。但是，將危險度分層也作為多變量之一進(jìn)行多因素分析時，35 d MRD不再是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素。同樣年齡大于10歲、診斷時白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞50×109/L以及T-ALL也同樣不再是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素。這可能是因?yàn)槲ｋU度分層已經(jīng)包涵了影響預(yù)后的診斷生物學(xué)特征以及基于MRD的治療反應(yīng)信息，更能體現(xiàn)預(yù)后的預(yù)測價值。此外，根據(jù)危險度分層進(jìn)行調(diào)整的治療強(qiáng)度也改變了具有包括MRD陽性等危險因素的患者的最終預(yù)后[5]。本研究大部分樣本來自SCMCALL-2005研究隊(duì)列后5年的病例，其中這個隊(duì)列的臨床記錄完整，所以也只對這些病例進(jìn)行了預(yù)后分析。同樣這部分患者的35 d MRD在單因素分析時可見非常顯著的預(yù)后影響，但在多因素分析中未能顯示顯著性。本研究對兒童ALL易感性相關(guān)的12個SNP位點(diǎn)與疾病預(yù)后進(jìn)行的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，無論是單因素分析還是和危險度分層等預(yù)后相關(guān)因素一起進(jìn)行多因素分析，SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多態(tài)性位點(diǎn)均與ALL預(yù)后顯著相關(guān)，表明這些遺傳因素是獨(dú)立于現(xiàn)行ALL風(fēng)險分層模型以外的獨(dú)立危險因素。這再次證實(shí)化療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，不僅取決于腫瘤細(xì)胞自身的遺傳特征，還取決于宿主固有的遺傳特征[20]。目前，根據(jù)分子標(biāo)志物調(diào)整治療強(qiáng)度是提高ALL治愈率的主要策略之一[4]。但是，由于研究數(shù)據(jù)相對缺乏，宿主的胚系遺傳特征通常不用于ALL患者危險度分層或治療強(qiáng)度的調(diào)整。候選基因研究表明，遺傳多態(tài)性影響白血病治療結(jié)果[12，14]。 也有研究表明與ALL易感性相關(guān)的SNP也與ALL預(yù)后相關(guān)[21]。如XU等[21]在2012年首次提出與ALL易感性相關(guān)的SNP也與ALL預(yù)后相關(guān)，該研究中發(fā)現(xiàn)ARID5B基因的rs10821936和rs10994982位點(diǎn)與ALL易感性相關(guān)但與預(yù)后無關(guān)。MOSAAD等[22]研究發(fā)現(xiàn)ARID5Brs10821936和rs10994982基因型之間的OS和DFS沒有顯著差異。MULLIGHAN等[23]研究表明IKZF1可以作為兒童ALL的腫瘤抑制因子，其丟失與預(yù)后不良有關(guān)。2017年BIELSKA等[24]報道IKZF1rs4132601基因多態(tài)性影響彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）的治療結(jié)果。2020年MOSAAD等[19]研究IKZF1rs4132601和rs11978267基因多態(tài)性與ALL預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)rs4132601 GG基因型是成人ALL預(yù)后不良的危險因素但與兒童ALL預(yù)后無關(guān)。本研究提示SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多態(tài)性位點(diǎn)與預(yù)后顯著相關(guān)，可作為指導(dǎo)患兒危險度分層的生物學(xué)標(biāo)志物，選擇合適的化療方案，提高預(yù)后。

表5 累積復(fù)發(fā)率的單因素和多因素Cox回歸分析（n=365）

SIAT7C屬于唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族，越來越多的研究表明，異常唾液酸化與惡性腫瘤的表型密切相關(guān)，包括增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性[25-26]。最近一項(xiàng)研究表明，唾液酸化和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可能是急性T淋巴細(xì)胞白血病多藥耐藥的潛在生物標(biāo)志物[27]。SIAT7Crs10873876多態(tài)性位點(diǎn)位于基因的內(nèi)含子上，內(nèi)含子可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率或通過影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，我們推測SIAT7Crs10873876 TC基因型影響ALL預(yù)后可能與抗白血病藥物耐藥有關(guān)。LOC102723724是一個RNA基因，屬于長非編碼RNA（lncRNAs），研究表明， lncRNAs轉(zhuǎn)錄物作為潛在的診斷和（或）預(yù)后生物標(biāo)志物出現(xiàn)在不同的人類疾病中，包括惡性血液病[28-29]。 有研究提出lncRNAs與ALL生存率差和復(fù)發(fā)趨勢增加有關(guān)[30-31]。因此，可能解釋LOC102723724rs11155133 GG基因型影響ALL預(yù)后的原因。

綜上所述，ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601為中國兒童ALL潛在易感性位點(diǎn)。本研究在中國兒童中報道SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133這兩個白血病易感性相關(guān)位點(diǎn)與兒童ALL預(yù)后相關(guān)，為白血病的診斷、治療及預(yù)防工作提供了一定的幫助，有必要針對以上SNP位點(diǎn)開展進(jìn)一步臨床試驗(yàn)研究。