冷玉玲，吳奇琛，何章勇，徐進，章京紅，吳東平，景奉香（通信作者）

（1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 腫瘤科，安徽 合肥 230001；2.海軍安慶醫(yī)院 胸外科，安徽 安慶 246003；3.上海奕檢醫(yī)療科技有限公司，上海 200000；4.上海小海龜科技有限公司研發(fā)部，上海 200000）

0 引言

臨床中80%的肺癌患者為非小細胞肺癌（NSCLC），大部分患者在首診后就處于中晚期，傳統(tǒng)治療手段如放化療等對于非小細胞肺癌的治療并不理想[1]。靶向治療是目前非小細胞肺癌治療的重要手段之一，如EGFRTKI抑制劑，針對有靶基因敏感突變的患者，治療的有效率會得到顯著的提高[2]。病理組織樣本是肺癌患者進行表皮生長因子受體（EGFR）基因檢測的首選標本，但實際檢測中組織樣本的獲取可能會受到多種臨床因素的制約，甚至部分患者會出現(xiàn)無法獲取組織樣本的情況[2]。目前以EGFR基因為代表性靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），是近年來NSCLC靶向治療的重點，而EGFR基因突變是治療的決定性條件，選擇合適的檢測方法（例液態(tài)活檢），篩選合適患者進行靶向治療是進行個體化精準治療的目標[3]。在腫瘤組織標本無法獲取情況下，國內(nèi)大多檢測方法選擇擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）檢驗，而dPCR利用外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進行EGFR基因突變檢測，這一新型檢測方式已經(jīng)獲得了廣泛認可[4]。本文將進一步分析與討論芯片式數(shù)字PCR技術(shù)對于外周血循環(huán)腫瘤DNA的EGFR突變檢測的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料。將2018年1月至2020年1月收治的40例NSCLC患者，含治療后耐藥患者18例。納入標準：①均經(jīng)過病理組織證實；②CT檢測病灶長徑≥10 mm；③心電圖肝腎功能正常；④知情本文相關(guān)研究。排除標準：①造血功能出現(xiàn)障礙；②妊娠及哺乳期患者。所有患者男18例，女22例，年齡30～80歲，平均（61.54±4.07）歲，患者分布見表1。

表1 患者分布

1.2 方法

（1）所有患者均空腹抽取靜脈血10 mL，耐藥患者在治療后抽取，2000×g離心5 min，取上清液，再次8000×g離心5 min，取上清，置于-20℃保存。

（2）血漿游離DNA提?。喊凑昭h(huán)DNA核酸提取試劑盒（廈門艾德公司，批號02216060701X）進行操作，使用Qubit2.0熒光定量儀和Agilent 2100生物分析儀，分析DNA濃度與片段大小。以DNA濃度大于20 ng/μL，其中DNA片段為170 bp左右為合格。

（3）ARMS檢測：使用ABI 7500熒光定量PCR儀及人類EGFR基因突變檢測試劑盒（廈門艾德公司，批號01217081601X）檢測EGFR基因突變，檢測按照試劑盒說明書進行操作，并判讀結(jié)果。

（4）dPCR檢測：使用上海小海龜科技有限公司的BioDigital·青數(shù)字化PCR儀，以及人類EGFR（19del/L858R）、EGFR（T790M）檢測試劑盒（批號1863103，1863104，863105，江蘇圣極基因科技有限公司），按照數(shù)字PCR系統(tǒng)及試劑盒說明書操作，檢測EGFR基因的突變情況，并對檢測結(jié)果進行分析與統(tǒng)計。

1.3 觀察（評價）指標。分析兩種檢測方法EGFR基因突變結(jié)果，以及dPCR法檢測EGFR基因突變豐度結(jié)果[5]。

1.4 統(tǒng)計學分析。本研究采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對本文數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ARMS法與dPCR法檢測EGFR基因突變結(jié)果。ARMS法共檢出22例患者，dPCR法共檢出26例患者，其中雙突變患者分別為3例與6例，見表2。

表2 兩種檢測方法EGFR基因突變結(jié)果

2.2 dPCR法檢測EGFR基因突變豐度結(jié)果。進行EGFR TKI抑制劑治療的患者中，p.T790M位點檢出6例，未進行治療的患者均未檢出該位點突變；所有EGFR的突變病例中，突變豐度≥1%的突變位點有23個，占總突變位71.88%（23/32），突變豐度＜1%，占28.12%（9/32）；接受TKI治療的患者T790M突變數(shù)為6例，豐度＜1%為4例，比例為66.67%（4/10），見表3。

表3 dPCR法檢測EGFR基因突變豐度結(jié)果

3 討論

近年來非小細胞肺癌診療在臨床已經(jīng)有了一定進步，患者一旦確診后，需要根據(jù)組織學與突變信息進行分類，再依據(jù)治療指南投藥；對于靶向藥物研究方面進展，適合進展期患者，在選擇藥物的時候能夠更加貼合患者實際情況[6]。而對肺癌患者進行病理組織樣本檢測，對后期治療具有重要意義，可是實際工作中受到多種因素的影響，會使得檢測出現(xiàn)一定影響[7]。隨著我國外周血循環(huán)腫瘤EGFR檢測的發(fā)展，臨床醫(yī)師也希望有更方便（外周血循環(huán)腫瘤DNA）及靈敏度更好（dPCR）的方法，來達到更好的治療提供更好的臨床結(jié)果及愈后，因此對檢測方式的要求也在不斷提高[8]。

芯片式數(shù)字PCR（dPCR）能提供更精準的檢測結(jié)果（絕對定量，精確度達0.01%）、更低的單次開機成本（單次檢測樣本通量高）、檢測費用可控制，血液樣本可動態(tài)監(jiān)測，同時也因為提高了患者的治療效益而獲益，見表4。

表4 dPCR法與ARMS法檢測EGFR基因突變對比

本文通過將兩種檢測方法納入研究，結(jié)果顯示：ARMS法共檢出22例患者，dPCR法共檢出26例患者，其中雙突變患者分別為3例與6例。能夠看出dPCR法檢出率較好，本文通過選擇3主要突變位點，在傳統(tǒng)PCR擴增前，對樣品進行微滴化處理，擴增技術(shù)后通過直接計劃的方法計算平均濃度[9]。由于dPCR法敏感性較高，暫無其他可靠的方法驗證，是否存在假陽性仍存在一定爭議。突變豐度≥1%的突變位點占總突變位71.88%（23/32），突變豐度＜1%占據(jù)28.13%（9/32）；接受治療的患者中，突變豐度＜1%比例為66.67（4/10）。雖然ARMS法也能夠檢出部分突變豐度＜1%的突變位點，但仍有部分低豐度突變的患者無法檢出，因此在檢測外周血EGFR基因突變后，尤其是TKI治療后的患者，可用dPCR法檢出更多低豐度突變的患者，使得更多患者更好的接受靶向治療[10]。與臨床使用的ARMS法相比，dPCR法檢測理論上精確度更好，選擇ARMS法檢測，判讀結(jié)果期間需要結(jié)合多種因素，包括患者耐受性，醫(yī)生及時與患者溝通，為了確保結(jié)果可靠更需要重復進行驗證[11]。

但本文研究樣本數(shù)較少，僅僅選取2年的患者進行研究，可能會使得研究結(jié)果出現(xiàn)一定偏差，后期臨床需要擴大樣本數(shù)量，結(jié)合dPCR可絕對定量的優(yōu)點，對基因突變豐度檢測，為靶向治療提供重要依據(jù)[12-13]。

綜上所述，非小細胞肺癌血液EGFR突變檢測期間，使用dPCR法檢測準確度較高，靈敏度高，能夠更好地指導臨床用藥，但在檢驗期間存在一定影響因素，因此需要規(guī)范化操作，確?；颊吒眠M行治療。