錢玉源，劉 祎，張 曦，王 燕，王廣恩，崔淑芳，李俊蘭

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051)

棉花種子的品質(zhì)不僅影響棉花的播種品質(zhì)(發(fā)芽勢及發(fā)芽率)[1]，而且影響附著其上纖維的品質(zhì)，因為棉纖維是由棉種子的表層細(xì)胞突起發(fā)育而成的，其優(yōu)劣很大程度上依賴于棉籽的營養(yǎng)供給[2]。此外，棉仁中含有20%～36%的脂肪酸和21%～45%的蛋白質(zhì)，是重要的油料和蛋白資源[3]。因此，研究棉花種子發(fā)育的調(diào)控機(jī)理對于改良纖維品質(zhì)、保障棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)及提高棉花的附加值具有重要意義。

種子發(fā)育涉及細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、器官發(fā)生和胞間通信等過程。研究表明，基因印記、代謝途徑、轉(zhuǎn)錄因子和激素信號在內(nèi)的復(fù)雜信號通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了種子的發(fā)育過程調(diào)控[4-8]?；蛴∮浭怯绊懛N子發(fā)育最常見的因素，Costa等[9]研究表明，玉米中母系印記基因Meg1在胚乳轉(zhuǎn)移細(xì)胞中表達(dá)，與種子的生長發(fā)育存在直接關(guān)系，證明該印跡基因在控制種子大小發(fā)育方面起著重要作用 。植物生長發(fā)育代謝途徑也是影響種子發(fā)育的重要因素，其中細(xì)胞周期調(diào)控、泛素-蛋白酶體降解途徑、ABC運輸?shù)鞍缀吞?氮代謝途徑等因素都會影響種子的發(fā)育[10-14]。轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控種子發(fā)育各個時期，WOX、HAP3等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控種子形態(tài)發(fā)育[15-17]，B3、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控種子成熟[18-20]，AP2/EREBP、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物種子大小[21-22]。另外，植物激素是影響種子生長發(fā)育的重要因素之一，許多植物激素相關(guān)基因被證實在調(diào)控植物種子發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。生長素在啟動種子的早期發(fā)育過程中具有重要作用，生長素信號途徑通過調(diào)控珠被細(xì)胞分裂調(diào)控種子的發(fā)育，并對決定種子的最終大小具有重要作用[23-24]。油菜素內(nèi)酯能夠促進(jìn)籽粒的發(fā)育，正調(diào)控籽粒大小的發(fā)育過程，但有關(guān)油菜素內(nèi)酯調(diào)控種子大小的分子機(jī)制尚不清楚[25-26]。脫落酸調(diào)控種子發(fā)育的許多過程，胚胎營養(yǎng)物質(zhì)的合成、種子休眠、抑制種子萌發(fā)等，對調(diào)控種子大小可能也有重要作用，對種子的大小起負(fù)調(diào)控作用[13，27]。赤霉素對植物種子萌發(fā)、打破種子休眠以及植物的花和種子的發(fā)育具有重要作用，赤霉素可能也調(diào)控種子大小[28-30]。miRNA可以調(diào)控ABA、生長素和油菜素甾醇類的信號傳導(dǎo)，從而可能影響種子發(fā)育[31]。雖然植物種子發(fā)育相關(guān)機(jī)理已有大量的研究結(jié)果，但棉花作為纖維作物，研究多集中在棉纖維發(fā)育方面，對于種子發(fā)育方面的研究較少。本研究通過測定棉花種子發(fā)育相關(guān)突變體ims-15和其近等基因系Ji737系種子發(fā)育中期的轉(zhuǎn)錄組，篩選差異表達(dá)基因，分析ims-15突變體中發(fā)生改變的代謝通路，為解析棉花種子發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

陸地棉品系Ji737系，由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)選育而成。

種子質(zhì)量突變體ims-15，是由Ji737系中自然突變經(jīng)8代自交純化而來。

1.2 取樣及數(shù)據(jù)調(diào)查

開花后，將Ji737系、ims-15分別掛牌標(biāo)記開花時間并自交，取開花后30 d的棉桃，3個生物學(xué)重復(fù)，剝?nèi)∨咧?，用液氮速凍后保存?80 ℃冰箱，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序。吐絮后收獲自交鈴，考種計算千粒質(zhì)量、衣分等。

1.3 種子發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組分析

委托上海派森諾生物科技有限公司完成RNA提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序。以30DPA(Day past anthesis) 的Ji737系、ims-15的種子為轉(zhuǎn)錄組分析材料，采用Illumina平臺進(jìn)行雙末端測序，以陸地棉TM-1的Ghirsutum_genome_HAU_v1.1基因組為參考基因組進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組分析，對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析、KEGG富集分析、轉(zhuǎn)錄因子分析。

1.4 實時熒光定量PCR驗證

選擇與種子發(fā)育相關(guān)的30個差異表達(dá)基因進(jìn)行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證。采用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取Ji737系、ims-15的30DPA種子的RNA，然后采用Fast King RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后作為模板；最后采用Fast Fire qRT-PCR PreMix(SYBR Green)試劑，以棉花的Histon3基因作為內(nèi)參基因，在Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR，每個基因設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)量(以上所用試劑均購于天根生化科技(北京)有限公司)。qRT-PCR用引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 ims-15突變體與Ji737系主要性狀比較

ims-15與Ji737系最直觀的差異是吐絮后ims-15的纖維不蓬松似僵瓣，種仁變小(圖1)；考種結(jié)果表明，千粒質(zhì)量降低了20.1%，衣分降低了27.92百分點，均存在極顯著差異(表2)。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 The primers used for qRT-PCR

表2 ims-15與Ji737的表型數(shù)據(jù)Tab.2 The trait data of ims-15 and Ji737

2.2 測序結(jié)果及質(zhì)量評估

本試驗6個測序樣品共獲得39 275 600 400 bp的原始數(shù)據(jù)(Raw bases)，堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上(Q30)的堿基占比為92.57%～93.47%；過濾后分別產(chǎn)生38 685 856，39 997 916，41 578 188，41 658 750，39 432 722,40 942 408個干凈序列，共36 344 376 000 bp 干凈數(shù)據(jù)；比對到參考基因組上的序列占比大于95%，其中只比對到一個位置的序列總數(shù)和比對到外顯子區(qū)域的序列占比均高于95%，表明測序結(jié)果良好，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析(表3)。

表3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量檢測Tab.3 Statistics and quality testing of sequencing data

2.3 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，以表達(dá)差異倍數(shù)絕對值|Fold change|>2，顯著性P-value<0.05作為篩選差異表達(dá)基因的閾值，從ims-15和Ji737系30DPA的種胚中篩選到4 239個差異表達(dá)基因，其中ims-15相比Ji737上調(diào)表達(dá)基因2 229個(52.6%)，下調(diào)表達(dá)基因2 010個(47.4%)。分析上、下調(diào)基因的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold change)，差異倍數(shù)2～10倍的差異基因在上、下調(diào)基因中均占比最高，分別為76%,91%；差異倍數(shù)大于20的上調(diào)基因數(shù)目多于下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目(圖2)。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

利用topGO對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，4 329個差異表達(dá)基因共富集到了375個條目，包含生物過程分類的228個條目、分子功能分類的112個條目、細(xì)胞組分分類的35個條目。根據(jù)GO富集結(jié)果，通過Rich factor、FDR值和富集到此GO 條目上的基因個數(shù)來衡量富集的程度，篩選出FDR值最小的即富集最顯著的前20個條目(圖3)。

其中包含于生物過程類別的7個條目是細(xì)胞壁高分子分解代謝過程、光合作用-光能捕獲、細(xì)胞壁高分子代謝過程、光合作用、細(xì)胞碳水化合物代謝過程和氧化還原過程；屬于分子功能類別的4個條目為葉綠素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、鐵離子結(jié)合和水解酶活性，作用于糖基鍵；屬于細(xì)胞組分類別的9個條目為光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)、光合膜、類囊體部分、類囊體、膜的整體組成、膜固有組成、膜和膜部分。三大類別中共有8個光合作用相關(guān)條目，依據(jù)富集程度由大到小依次為光合作用-光能捕獲、光系統(tǒng)Ⅰ、葉綠素結(jié)合、光系統(tǒng)、光合膜、光合作用、類囊體部分和類囊體。富集于這8個條目的差異基因共47個，其中在突變體中下調(diào)表達(dá)基因40個，占85.11%，且富集到光能捕獲、葉綠素結(jié)合和光系統(tǒng)Ⅰ等條目的差異基因在突變體中均下調(diào)表達(dá)(表4)。

表4 光合作用相關(guān)條目中的差異表達(dá)基因Tab.4 The DEGs in photosynthesis-related terms

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

差異表達(dá)基因被注釋到117個代謝通路中，主要涉及細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機(jī)系統(tǒng)5個大類18個小類。進(jìn)一步從117個代謝途徑中篩選出光合作用-天線蛋白、類黃酮生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素的生物合成、絲裂原活化蛋白激酶信號途徑(MAPK信號途徑)、糖酵解/糖異生、淀粉和蔗糖代謝等顯著富集的代謝通路20個(圖4)，其中脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝的相關(guān)通路分別有6，5個，占顯著富集代謝通路的55%；能量代謝、碳代謝、其他次級代謝產(chǎn)物生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路各2個；輔助因子和維生素代謝相關(guān)通路1個(表5)。

表5 顯著富集生物過程的功能分類Tab.5 Functional classification of significantly enriched biological processes

光合作用-天線蛋白是富集程度最高的通路，參與該通路的18個差異基因在ims-15中均下調(diào)表達(dá)。另外，顯著富集的光合作用通路中共有26個差異基因，其中23個在ims-15中下調(diào)表達(dá)(表6)。

表6 光合作用相關(guān)通路中差異表達(dá)基因Tab.6 DEGs in photosynthesis-related pathways

植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是顯著富集的代謝通路中注釋到差異基因數(shù)目最多的通路，說明植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在種子發(fā)育中起著重要作用。分析不同激素通路發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)脂信號通路中富集到的6個差異基因均下調(diào)表達(dá)；乙烯信號通路中富集到上調(diào)基因15個，下調(diào)基因1個；細(xì)胞分裂素信號通路中富集到上調(diào)基因8個，下調(diào)基因1個；生長素信號通路中富集到下調(diào)基因22個，上調(diào)基因9個；脫落酸信號通路中富集到上調(diào)基因14個，下調(diào)基因5個；赤霉素信號通路中富集到上調(diào)基因4個，下調(diào)基因3個；茉莉酸信號通路中富集到上調(diào)基因6個，下調(diào)基因2個；水楊酸信號通路中富集到上、下調(diào)基因各1個(圖5)。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子分析

種子發(fā)育受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，通過轉(zhuǎn)錄因子分析，篩選到448個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，分屬于41個轉(zhuǎn)錄因子家族，包含bHLH、MYB、WRKY、NAC、bZIP、MADS-box、Dof、B3、WOX、AP2/EREBP等已被證實參與種子發(fā)育調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族(圖6)。其中，ERF、bHLH、MYB 3個轉(zhuǎn)錄因子家族包含的差異表達(dá)基因明顯多于其他家族，分別包含59，56，49個差異表達(dá)基因。

2.7 熒光定量驗證RNA-seq結(jié)果

為了驗證RNA-seq差異分析的準(zhǔn)確性，從富集程度最高的光合作用-天線蛋白通路、注釋到差異基因最多的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及起調(diào)控種子發(fā)育作用的轉(zhuǎn)錄因子家族中篩選出30個差異表達(dá)基因進(jìn)行了qRT-PCR分析，并對RNA-seq和qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析，兩者的相關(guān)系數(shù)R2=0.955 9，說明RNA-seq的結(jié)果準(zhǔn)確可靠(圖7)。驗證基因中包含4個光合作用-天線蛋白通路的基因，分別為Ghir_A03G019040(CAP10A)、Ghir_A05G015460(CAB21)、Ghir_A07G007230(LHCA4)、Ghir_D01G006310(CAB13)； qRT-PCR的結(jié)果顯示該4個基因在ims-15中的表達(dá)量較Ji737分別降低4.25，14.33，7.31，5.91倍；這與RNA-seq結(jié)果中富集到光合作用-天線蛋白通路的基因均下調(diào)表達(dá)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究利用RNA-seq分析了棉花種子發(fā)育異常突變體(ims-15)及其近等基因系(Ji737系，種子發(fā)育正常)發(fā)育中期種胚的轉(zhuǎn)錄本差異。與發(fā)育正常種胚相比，在ims-15種胚中共有2 229個基因上調(diào)表達(dá)，2 010個基因下調(diào)表達(dá)。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集在光合作用相關(guān)的條目； KEGG富集分析表明光合作用-天線蛋白是富集程度最高的通路，富集到該通路的差異表達(dá)基因在ims-15中均下調(diào)表達(dá)；植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是富集到差異表達(dá)基因最多的通路；轉(zhuǎn)錄因子分析表明，多個基因家族參與種子發(fā)育調(diào)控。

胚性光合作用在合成種子貯存物質(zhì)中起重要作用。許多植物的種子在胚胎發(fā)生期間是綠色的，雖然種子主要是庫組織，但它們含有葉綠體，具有典型光合作用機(jī)制的類囊體結(jié)構(gòu)和酶[32]。種子中的光合作用至少可以通過3種方式增加生物合成通量：光反應(yīng)可以產(chǎn)生NADPH和ATP，用于能量需求大的脂肪酸生物合成；氧氣的釋放可能有助于防止種子內(nèi)缺氧[22]；暗反應(yīng)可以通過固定呼吸產(chǎn)生的CO2為新陳代謝提供中間體來提高種子的生物合成效率[33]。本研究中Ji737和ims-15種子發(fā)育期差異表達(dá)的基因顯著地富集于光合作用，且差異基因大多在ims-15中下調(diào)表達(dá)，尤其是參與光合作用-光能捕獲的基因在ims-15均下調(diào)表達(dá)。因此，推測ims-15光捕獲能力下降，致使胚性光合作用能力降低，是造成種子質(zhì)量降低的直接原因。

植物激素是影響種子生長發(fā)育的重要因素之一，不同植物激素在種子發(fā)育的不同階段發(fā)揮著不同的作用[34]。本研究中植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是注釋到差異基因數(shù)目最多的代謝途徑，其中ims-15中起正調(diào)控種子大小發(fā)育功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下調(diào)基因的數(shù)目顯著多于上調(diào)基因數(shù)目，包括生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下調(diào)基因22個、上調(diào)基因9個，油菜素內(nèi)酯途徑中6個差異表達(dá)基因均為下調(diào)[23-26]。相反，起負(fù)調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中上調(diào)基因數(shù)目顯著多于下調(diào)基因數(shù)，其中細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中上調(diào)基因8個、下調(diào)基因僅1個，脫落酸轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中上調(diào)基因14個、下調(diào)基因5個[27-28]。這些結(jié)果說明植物激素變化對ims-15種子質(zhì)量降低起著重要作用。

種子發(fā)育同時受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[35]，它們與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑結(jié)合，構(gòu)成一個調(diào)控種子發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控和監(jiān)管整個發(fā)育過程。在本研究中篩選獲得了大量的影響種子質(zhì)量形成的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，包括調(diào)控胚乳發(fā)育、貯藏蛋白合成和脂肪含量的Dof家族[36]，調(diào)控種子體積大小的WRKY 家族[37]，調(diào)控種子大小、種子貯藏物質(zhì)積累的AP2/EREBP家族等[38]，說明轉(zhuǎn)錄因子活性的變化對ims-15種子質(zhì)量降低起著重要作用。

本研究通過對種子質(zhì)量突變體ims-15和其正常種子質(zhì)量近等基因系Ji737種子發(fā)育期轉(zhuǎn)錄水平的差異分析，發(fā)現(xiàn)了一些與種子質(zhì)量發(fā)育密切相關(guān)的代謝途徑，尤其是胚性光合作用途徑在種子質(zhì)量形成中起重要作用；發(fā)現(xiàn)了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄因子在種子質(zhì)量形成中起著重要調(diào)控作用。