邵 鈺，尚 瓊，郭 蓉，葛米雪，周紅艷，楊顏菁,3

齲病治療目前主要依靠渦輪高低速手機(jī)去除腐質(zhì)，但會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)、噪聲等問(wèn)題。隨著微創(chuàng)治療中減輕患者的疼痛并取得更好的治療效果觀念的普及，微創(chuàng)治療的這種原則也逐漸應(yīng)用于口腔臨床中。在眾多微創(chuàng)治療方法中，Er：YAG激光作為治療齲病的一種新技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注。Er：YAG激光可以精準(zhǔn)到小于1 mm的口腔區(qū)域，這使得在使用Er：YAG激光去除受感染的牙本質(zhì)的同時(shí)，能夠最大限度地保留周圍健康的組織。一些研究表明，Er：YAG還可以減少去齲過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)高溫度，高溫對(duì)牙髓活力可能產(chǎn)生不利的影響[1-2]。Er：YAG激光已經(jīng)在兒童口腔科中得到了廣泛的應(yīng)用[3]。盡管Er：YAG激光在口腔科領(lǐng)域顯示出了很大的潛力，但目前尚缺乏科學(xué)證據(jù)來(lái)闡明其在洞形制備和粘接修復(fù)中的具體作用機(jī)制。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)Er：YAG激光和傳統(tǒng)機(jī)械方法在粘接強(qiáng)度、微滲漏和去齲操作時(shí)間等許多方面沒(méi)有差異。

本實(shí)驗(yàn)旨在為Er：YAG激光去除齲壞和粘接修復(fù)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較Er：YAG激光和常規(guī)機(jī)械方法制備窩洞的微拉伸強(qiáng)度和微滲漏深度，并通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察兩種方法制備的牙面，從組織學(xué)的角度評(píng)價(jià)這兩種牙本質(zhì)去除方法的治療效果并測(cè)定各自的去齲時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 離體牙收集

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：PJ-2017-033-001)并經(jīng)患者同意，本研究收集因牙周病變或阻生而新鮮拔除的人恒磨牙36顆，其牙合面有達(dá)牙本質(zhì)深層的齲壞，為Ⅴ類洞。同時(shí)經(jīng)放射學(xué)檢查，排除靜止齲、繼發(fā)齲和已露髓的牙齒。去除牙齒周圍的軟組織并清除牙菌斑和根面牙石[4]。所有離體牙在4 ℃的生理鹽水中保存，并在1周內(nèi)使用。36顆離體牙隨機(jī)編號(hào)為1～36。

1.2 樣品制備和分組

用低速切割機(jī)(Isomet，美國(guó))將離體牙的每個(gè)齲損切成大小大致相等的兩半(圖1)，分成A、B兩個(gè)樣本，A樣本納入對(duì)照組，B樣本納入實(shí)驗(yàn)組[2]。實(shí)驗(yàn)組按照 Er：YAG激光治療儀(Fotona M002-3A/4，德國(guó))的臨床操作規(guī)程進(jìn)行去齲，并采取以下措施：①操作者和助手佩戴護(hù)目鏡；②實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為切割牙釉質(zhì)，300 mJ，30 Hz；切割牙本質(zhì)，200 mJ，20 Hz；③進(jìn)行光纖頭距齲壞部位1 mm的非接觸掃描照射；④評(píng)估和再次照射，直至所有齲壞被清除。對(duì)照組采用高速手機(jī)去除無(wú)基釉以及釉牙本質(zhì)交界處的腐質(zhì)，然后用低速手機(jī)徹底去除腐質(zhì)，達(dá)到去除軟化著色牙本質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

離體牙根據(jù)齲洞被均勻地切成兩半

1.3 微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)試

編號(hào)為1～13的牙齒，用于測(cè)試微拉伸粘接強(qiáng)度(mTBS)。用Er：YAG激光去除齲壞組織或用手機(jī)去腐，直到肉眼和探診檢查都認(rèn)為去盡腐質(zhì)。所有的工作由同一個(gè)研究人員完成。沖洗和干燥后，用自酸蝕粘接劑(3M Adper Easy One，美國(guó))處理窩洞，并用通用納米樹(shù)脂(FiltekTMZ350XT，美國(guó))修復(fù)。充填后置于37 ℃生理鹽水中24 h。將牙冠分離后，用低速切割機(jī)(Isomet，美國(guó))將牙本質(zhì)-樹(shù)脂粘接面(窩洞側(cè)壁)制成1 mm×1 mm的啞鈴形試件(圖2)。每個(gè)樣本可制備2～4個(gè)實(shí)驗(yàn)試件。用502膠粘劑(氰基丙烯酸酯粘合劑)將試件固定到微拉伸測(cè)力儀上(BISCO，美國(guó))，并施加拉應(yīng)力，直到斷裂。然后測(cè)量拉伸斷口的載荷數(shù)值(N)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量斷面的邊長(zhǎng)。mTBS(MPa)=試樣拉斷時(shí)的載荷(N)/斷面處截面積(mm2)。測(cè)試重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

圖2 將試件固定在測(cè)試夾具上進(jìn)行微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)試Fig.2 Test pieces fixed on the test fixture for the microtensile bond strength test

1.4 微滲漏測(cè)試

編號(hào)為14～26的牙齒用于測(cè)試微滲漏深度。從去齲到修復(fù)的操作程序與微拉伸粘接強(qiáng)度試驗(yàn)中的操作程序相同。樣品保存在37 ℃的生理鹽水中。隨后，樣品置于5 ℃和55 ℃的冷熱循環(huán)儀(Will，中國(guó))中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次浸泡30 s，交替5 000次。在距離粘接邊緣1 mm處涂3層無(wú)色指甲油，以防止正常牙齒染色。標(biāo)本在1%堿性品紅中浸泡24 h后，切成1 mm厚的切片，體視顯微鏡(Nikon，日本)20倍下觀察，并測(cè)量染料滲透深度(最深處至界面的垂直距離)。

1.5 組織學(xué)評(píng)價(jià)

編號(hào)為27～32的牙齒用于組織學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6個(gè)樣本，去齲方法與前述方法相同。截去牙根，在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，10%硝酸脫鈣、脫水后石蠟包埋，全自動(dòng)半薄輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，厚度4 μm樣本各制20張切片。從所有標(biāo)本中隨機(jī)抽取8張切片，HE染色。HE染色步驟：樣品依次用二甲苯Ⅰ和Ⅱ以及100%、95%、80%和75%乙醇脫蠟，然后用蘇木精和伊紅染色，并以乙醇的升序(75%、80%、95%和100%)脫水。最后，每張切片用中性樹(shù)膠封住，在正置熒光顯微鏡(LEICA，德國(guó))200倍視野下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。在窩洞底部中央連續(xù)觀察6個(gè)視野。牙本質(zhì)小管被染成藍(lán)紫色的部分，是殘留的細(xì)菌以及碎屑，記為“感染”的牙本質(zhì)小管，統(tǒng)計(jì)6個(gè)視野內(nèi)感染牙本質(zhì)小管的數(shù)量，評(píng)分如下，0：無(wú)感染牙本質(zhì)小管；1：1～10個(gè)感染牙本質(zhì)小管；2：10～20個(gè)感染牙本質(zhì)小管；3：20個(gè)以上感染牙本質(zhì)小管。

1.6 掃描電子顯微鏡評(píng)價(jià)

取編號(hào)為33～36的牙齒，用掃描電子顯微鏡觀察牙本質(zhì)表面形態(tài)。用Er：YAG激光(n=4)和傳統(tǒng)器械(n=4)進(jìn)行去齲。將標(biāo)本制成大小相同(4.0 mm×4.0 mm×2.5 mm)的牙體組織塊，并對(duì)其底部進(jìn)行拋光處理。然后將其浸泡在2.5%戊二醛溶液中固定。經(jīng)50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水后，用HELIOS NanoLab 600i電子顯微鏡進(jìn)行表面形貌觀察。使用掃描電子顯微鏡在兩個(gè)放大倍數(shù)下進(jìn)行分析：2 000倍和3 500倍。

1.7 去齲時(shí)間

記錄前4部分實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的去齲時(shí)間，以開(kāi)始去腐為始，以明確達(dá)到臨床腐質(zhì)去盡標(biāo)準(zhǔn)為終，計(jì)算平均去齲時(shí)間并進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的mTBS、微滲漏深度、組織學(xué)實(shí)驗(yàn)和去齲時(shí)間等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在所有的檢驗(yàn)中，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微拉伸粘接強(qiáng)度

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均mTBS值和標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組有更好的微拉伸粘接強(qiáng)度。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的微拉伸粘接強(qiáng)度

2.2 微滲漏深度

用體視顯微鏡在放大20倍的視野下觀察切片中染料的滲透深度如圖3所示。兩組的平均微滲漏深度如表2所示，雖然實(shí)驗(yàn)組的平均微滲漏深度低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059)。

A：對(duì)照組的部分；B：實(shí)驗(yàn)組的部分

P>0.05

2.3 組織學(xué)分析

牙本質(zhì)小管染色視野如圖4所示。傳統(tǒng)機(jī)械治療的洞底光滑、平整、連續(xù)，而Er：YAG激光去齲的洞底粗糙、熔化、凹凸不平。感染牙本質(zhì)染色分析結(jié)果如表3所示。兩組間感染牙本質(zhì)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。

A：對(duì)照組組織切片( ×200)顯示牙本質(zhì)小管大量破壞和細(xì)菌阻塞，腔底光滑連續(xù)；B：實(shí)驗(yàn)組組織切片( ×200)顯示牙本質(zhì)小管少量破壞，細(xì)菌殘留較少，腔底不規(guī)則粗糙

2.4 掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡觀察結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組牙本質(zhì)表面形成一層厚厚的玷污層，牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)不清、數(shù)量少、管腔栓塞。相反，實(shí)驗(yàn)組的牙本質(zhì)表面無(wú)玷污層且高低起伏呈魚(yú)鱗狀，牙本質(zhì)小管開(kāi)口清晰，管內(nèi)未見(jiàn)栓塞。

表3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組感染牙本質(zhì)評(píng)分

A1和A2：對(duì)照組牙本質(zhì)表面形態(tài)(A1： ×2 000；A2： ×3 500)，洞形表面不規(guī)則，有玷污層，少數(shù)牙本質(zhì)小管開(kāi)放；B1和B2：實(shí)驗(yàn)組牙本質(zhì)表面形態(tài)(B1： ×2 000；B2： ×3 500)呈層次化鱗片狀，有大量開(kāi)放的牙本質(zhì)小管

2.5 去齲所需時(shí)間

表4顯示了Er：YAG激光和傳統(tǒng)機(jī)械法的平均去齲時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組去齲所需的時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的去齲時(shí)間Tab.4 Duration of caries removal of the control and study groups

3 討 論

齲病是世界上最常見(jiàn)的口腔疾病，在成人和兒童中有很高的患病率[5-6]。傳統(tǒng)的去除齲壞的方法依賴于渦輪手機(jī)[6]。這種廣泛使用的方法快速方便，但會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)和聲音，從而引起許多患者(特別是兒童)的焦慮和不適。此外，這種依賴于觸覺(jué)和光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)去除齲壞的機(jī)械方法存在過(guò)度去除健康牙齒或遺留齲壞組織的可能，這兩種結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致牙髓損傷或感染[7]。近年來(lái)，微創(chuàng)的概念在口腔科，特別是兒童口腔科得到了發(fā)展，它側(cè)重于減輕患者的疼痛并取得更好的效果。遵循微創(chuàng)牙科的原則，相繼提出了多種可選擇的非侵入性方法，包括激光去齲法、非創(chuàng)傷性修復(fù)治療(ART)、新型聚合物切割器械(塑料和陶瓷切割器械)、氣磨法、聲波法和化學(xué)機(jī)械法等[8-9]。

傳統(tǒng)的機(jī)械方法在除齲過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生噪聲和震動(dòng)，給患者尤其是兒童帶來(lái)不適和恐懼，解決這些不足迫切需要新技術(shù)的出現(xiàn)[10]。在齲病治療中引入和應(yīng)用Er：YAG激光可作為傳統(tǒng)手機(jī)的一種新的替代措施。1964年，Goldman首次將激光應(yīng)用于治療齲齒[11]。1997年，在獲得美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)的批準(zhǔn)后，口腔科引入了Er：YAG激光，用于去除齲壞和制備洞形[10]。Er：YAG激光去除齲壞的基本作用機(jī)制是它對(duì)齲壞牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)中水分子的熱效應(yīng)。水和羥基磷灰石的吸收峰與Er：YAG激光的2 940 nm波長(zhǎng)重合，將吸收大量的激光能量而產(chǎn)生熱,溫度迅速升高，汽化，進(jìn)而產(chǎn)生微爆炸使牙體硬組織結(jié)構(gòu)破碎，達(dá)到切割硬組織的目的。由于齲齒組織比健康的牙體組織含有更多的水分，對(duì)Er：YAG激光的高吸收性，使Er：YAG激光成為了一種可選擇的去齲方法，減少波及健康的牙齒結(jié)構(gòu)[1]。與傳統(tǒng)方法相比，Er：YAG激光具有許多不可否認(rèn)的優(yōu)點(diǎn)，如在洞形制備過(guò)程中震動(dòng)和噪音小，減少了局部麻醉的使用，可以減少患者的恐懼和不適等。

充填物與牙體組織的粘接存在幾個(gè)問(wèn)題，如充填材料斷裂和邊緣微滲漏等[4,12-14]。這些都是充填體臨床耐久性面臨的主要挑戰(zhàn)。微拉伸粘接強(qiáng)度和微滲漏深度是近年來(lái)研究中評(píng)價(jià)充填體粘接質(zhì)量的主要指標(biāo)。1995年，Pashley 等考慮到較小的粘接面積(<2 mm×2 mm)能更準(zhǔn)確地反映實(shí)際粘接強(qiáng)度，提出了微拉伸粘接強(qiáng)度的概念。由于粘接面較小，壓力更加均勻，試件的斷裂部位主要發(fā)生在粘接面[15-16]。在本實(shí)驗(yàn)中，微拉伸試件被制成啞鈴形，從而使粘接面積盡可能小，并控制在1 mm2內(nèi)[17]。在目前的體外研究中，使用Er：YAG激光與傳統(tǒng)的機(jī)械方法相比獲得了更好的粘接強(qiáng)度。樹(shù)脂和牙體組織之間的微滲漏會(huì)影響邊緣封閉，并導(dǎo)致繼發(fā)齲、牙齒過(guò)敏、病理性牙髓改變或充填體松動(dòng)等后果[12]。除了樹(shù)脂和粘接劑體系的粘接質(zhì)量和聚合收縮外，微滲漏的發(fā)生還與窩洞制備過(guò)程中使用的工具有關(guān)[14,18]。在本研究中，我們認(rèn)為與傳統(tǒng)方法相比，Er：YAG激光去齲可以減少樹(shù)脂修復(fù)技術(shù)的微滲漏，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異。我們的結(jié)果與Yaman 等的結(jié)果是一致的[19]。據(jù)報(bào)道，牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)表面紋理的物理變化可能會(huì)影響微滲漏，這與Er：YAG激光的照射頻率和時(shí)間有關(guān)。較高的照射頻率和照射時(shí)間可導(dǎo)致牙本質(zhì)熔化和重結(jié)晶[12]，從而使牙本質(zhì)組織的膠原纖維融合，減少樹(shù)脂向纖維間隙和管間擴(kuò)散。此外，牙本質(zhì)熔化可能與Er：YAG激光束的類型、劑量或角度有關(guān)，這可能導(dǎo)致了微滲漏深度不同的結(jié)果。

現(xiàn)代理念認(rèn)為去除牙本質(zhì)齲是去除大部分受感染的軟化齲壞組織，以防止微生物入侵，保護(hù)牙髓活力，并為修復(fù)準(zhǔn)備合適的窩洞[2,20]。以往的研究表明，較高頻率的Er：YAG激光(25～30 Hz)會(huì)導(dǎo)致受激光照射的牙本質(zhì)產(chǎn)生裂紋、熔融等熱損傷現(xiàn)象，而傳統(tǒng)機(jī)械制備則會(huì)產(chǎn)生明顯的玷污層[2,21]。在目前的體外研究中，我們根據(jù)牙本質(zhì)小管中細(xì)菌沉積的數(shù)量來(lái)評(píng)估去齲的效果，顯示Er：YAG激光對(duì)感染牙本質(zhì)的清潔效果優(yōu)于傳統(tǒng)機(jī)械法，對(duì)照組的組織切片中斷裂的牙本質(zhì)小管融合成串珠狀，而實(shí)驗(yàn)組的牙本質(zhì)小管幾乎沒(méi)有阻塞和膨脹。另一個(gè)不同之處在于傳統(tǒng)渦輪機(jī)處理的洞底比Er：YAG激光處理的洞底部更平整。

我們通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察到，經(jīng)Er：YAG激光處理的牙本質(zhì)表面微形態(tài)清晰，牙本質(zhì)小管開(kāi)放、清晰，與Sallam等[15]和Chiniforush等[22]的研究結(jié)果一致。關(guān)于牙本質(zhì)齲的治療，玷污層的存在會(huì)使樹(shù)脂和粘接劑系統(tǒng)的粘接強(qiáng)度降低，而牙本質(zhì)小管的開(kāi)放則可以增強(qiáng)修復(fù)材料和牙體之間的粘接強(qiáng)度[22]。SEM結(jié)果也證實(shí)了Er：YAG激光照射組具有較高的結(jié)合強(qiáng)度。然而，由于本研究的局限性，在使用Er：YAG激光或傳統(tǒng)機(jī)械進(jìn)行窩洞預(yù)備后，沒(méi)有對(duì)牙本質(zhì)和樹(shù)脂之間的相互作用模式進(jìn)行SEM評(píng)估。

使用Er：YAG激光去除齲壞所花費(fèi)的平均時(shí)間明顯高于使用傳統(tǒng)機(jī)械法去除齲壞所需的平均時(shí)間。與之前的一項(xiàng)研究[3]是一致的?？赡苁且?yàn)镋r：YAG激光的使用時(shí)間包括手動(dòng)切換參數(shù)的時(shí)間，導(dǎo)致了Er：YAG激光的工作時(shí)間較長(zhǎng)。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)的情況。因此，還需要對(duì)Er：YAG激光用于乳牙和恒牙的釉質(zhì)齲和牙本質(zhì)齲的窩洞制備進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究進(jìn)一步證實(shí)了Er：YAG激光用于牙釉質(zhì)齲和牙本質(zhì)齲治療的可行性。與傳統(tǒng)的機(jī)械制備方法相比，Er：YAG激光的使用可提高樹(shù)脂與牙本質(zhì)組織的粘接強(qiáng)度，減少牙本質(zhì)小管中的細(xì)菌殘留，是一種高效的窩洞制備方法。此外，有效去除玷污層和隨后暴露開(kāi)放的牙本質(zhì)小管也是實(shí)驗(yàn)組粘接強(qiáng)度增加的促進(jìn)因素。然而，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的平均微滲漏深度沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的去齲時(shí)間較對(duì)照組長(zhǎng)。本研究結(jié)果為選擇Er：YAG激光去齲提高臨床治療效果提供了依據(jù)。