陳蓉 雷明明 何宗亮 朱歡喜 戴子淳 應(yīng)詩家

摘要：?為了揭示櫻桃谷鴨種公鴨的睪丸發(fā)育規(guī)律，本研究以75日齡、105日齡、135日齡和165日齡櫻桃谷鴨種公鴨為研究對象，首先通過組織學(xué)方法觀察睪丸發(fā)育和精子發(fā)生情況，其次通過Q-PCR方法檢測下丘腦-腦垂體-睪丸軸組織中相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與105日齡相比，135日齡時睪丸質(zhì)量增加了10倍以上，曲精細(xì)管直徑和上皮生精細(xì)胞數(shù)量增加，腦垂體FSHβ基因mRNA表達(dá)量增加了40倍以上。與75日齡相比，105～165日齡腦垂體組織中GnIHR基因mRNA表達(dá)量顯著降低。隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸支持細(xì)胞特異性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因和間質(zhì)細(xì)胞特異性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表達(dá)量顯著增加。以上結(jié)果表明，自135日齡開始，在腦垂體FSH和LH刺激下，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸進(jìn)入快速發(fā)育階段，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng);165日齡時，睪丸能夠產(chǎn)生成熟精子，表明睪丸發(fā)育達(dá)到性成熟階段。本研究結(jié)果為后續(xù)櫻桃谷鴨種鴨的繁殖研究提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：?櫻桃谷鴨;睪丸;生殖軸;基因表達(dá)

中圖分類號：?S834??文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0405-07

Abstract：?In order to understand the testicular development of Cherry Valley breeder ducks， this study took 75， 105， 135， and 165 day-old Cherry Valley breeder ducks as the research objects. Firstly， the testicular development and spermatogenesis were defined through histological methods， and secondly the mRNA expression levels of reproductive axis genes were detected by the method of Q-PCR. The results showed that compared with the 105th day， the testicular weight of Cherry Valley breeder ducks on the 135th day increased by more than 10 times with the increase of the diameter of seminiferous tubules and the number of epithelial spermatogenic cells， and the mRNA expression level of their pituitary FSHβ gene increased by more than 40 times. Compared with the 75th day， the mRNA expression level of pituitary GnIHR gene was significantly reduced on the 105th， 135th， and 165th day respectively. With the increase of days， both the mRNA expression levels of sertoli cell-specific FSHR， INHα， INHβA， AMH genes and Leydig cell-specific LHR， StAR， CYP11A1， 3β-HSD genes were significantly increased in the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks. The above results suggested that the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks had underwent the rapid development since the 135th day under the stimulation of FSH and LH of the pituitary gland， and the secretory function of both Sertoli cells and Leydig cells was enhanced; on the 165th day， the testes could produce mature sperms， indicating that the testicular development had reached sexual maturity. This study provides the basic data for the subsequent research on the reproductive activity of Cherry valley breeder ducks.

Key words：?Cherry valley drake;testis;reproductive axis;gene expression

中國是世界肉鴨養(yǎng)殖和消費(fèi)大國，2019年肉鴨出欄質(zhì)量約占全球68%[1]。2019年，中國肉鴨總出欄量約4.43×109只，總產(chǎn)肉量約9.44×106 t，鴨肉總產(chǎn)值達(dá)到1.42×1011元。在中國，大量飼養(yǎng)的肉用型鴨品種包括北京鴨、櫻桃谷鴨、麗佳鴨、狄高鴨等。櫻桃谷鴨是以北京鴨為育種材料選育而成的，具有生長速度快、瘦肉率高和飼料轉(zhuǎn)化率高以及抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，與中國地方蛋用型鴨（如連城白鴨）相比，櫻桃谷鴨（肉用型）種鴨體型大，性成熟時間晚。目前，有關(guān)櫻桃谷種鴨的研究主要集中在養(yǎng)殖模式升級和產(chǎn)蛋性能提高方面[2-3]，對于其性成熟啟動和睪丸發(fā)育的研究很少。

禽類性腺發(fā)育過程受到下丘腦-腦垂體-性腺軸的內(nèi)分泌調(diào)控[4]。在性成熟前某一時間點(diǎn)，下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone， GnRH）脈沖釋放增加，引起腦垂體卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone， FSH）和黃體生成素（Luteinizing hormone， LH）的分泌增加，進(jìn)而刺激性腺發(fā)育[5-6]。此外，F(xiàn)SH和LH分泌受到下丘腦促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone， GnIH）的調(diào)控[7]。在睪丸組織中，F(xiàn)SH通過特異性受體（FSH receptor， FSHR）作用于支持細(xì)胞，促進(jìn)支持細(xì)胞增殖和分化;LH則通過特異性受體（LH receptor， LHR）作用于間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)睪酮合成和分泌。睪酮是維持精子產(chǎn)生過程所必需的，主要通過旁分泌方式作用于支持細(xì)胞間接調(diào)控精子產(chǎn)生[8]。支持細(xì)胞能夠分泌多種生長因子，如抑制素A（INHα和INHβA亞基形成的異二聚體）負(fù)反饋調(diào)控腦垂體FSH分泌[9]，抗繆勒氏管激素（Anti-mullerian hormone， AMH）抑制間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮[10]。為了揭示櫻桃谷鴨種公鴨的睪丸發(fā)育規(guī)律，本研究擬以不同日齡的櫻桃谷鴨種公鴨為研究對象，首先通過組織學(xué)方法觀察睪丸發(fā)育和精子產(chǎn)生情況，其次通過實(shí)時定量PCR（Real-time quantitative PCR， Q-PCR）方法檢測下丘腦-垂體-睪丸軸組織中基因表達(dá)情況。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)動物

選取櫻桃谷鴨種鴨（父母代）雛鴨140只（公鴨母鴨各70只），飼養(yǎng)于南京市畜牧家禽科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地。地面育雛結(jié)束后，采用半舍內(nèi)飼養(yǎng)方式進(jìn)行混群飼養(yǎng)，舍內(nèi)設(shè)有獨(dú)立的飼槽，舍外設(shè)有水上運(yùn)動場。人工定時定量喂料，衛(wèi)生防疫工作按照種鴨飼養(yǎng)管理基本要求進(jìn)行，日糧營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)按照種鴨標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制。

1.2?樣本采集與激素測定

分別隨機(jī)選取75日齡、105日齡、135日齡和165日齡公鴨各8只，宰前禁食12 h，稱取活體質(zhì)量后，翅靜脈采血，靜置30 min后分離血清，-20 ℃保存。經(jīng)頸部放血致死后，采集左右兩側(cè)睪丸組織并稱質(zhì)量。其中，左側(cè)睪丸組織一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片制作;一部分置于液氮中快速冷凍，用于總RNA提取。同時，采集每個個體的下丘腦和腦垂體組織，置于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存。

采用北京北方生物技術(shù)研究所有限公司睪酮檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）進(jìn)行血清睪酮質(zhì)量濃度測定。

1.3?石蠟切片制作和組織學(xué)觀察

睪丸組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，各日齡公鴨隨機(jī)挑選3個樣本，每個樣本切取一小塊組織（0.125 cm3），首先置于乙醇梯度溶液（體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、90%和95%乙醇）中進(jìn)行逐級脫水，然后置于二甲苯溶液中進(jìn)行透明處理2次，最后置于石蠟中進(jìn)行透蠟處理，并制備成石蠟塊。石蠟切片（5 μm）固定于載玻片上，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。染色切片置于光學(xué)顯微鏡下拍照并觀察曲精細(xì)管直徑以及精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞數(shù)量。

1.4?基因表達(dá)分析

采用動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測RNA的純度（OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.0）和含量。采用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品]以總RNA為模板合成互補(bǔ)cDNA第一鏈。

根據(jù)GenBank中綠頭鴨或者近緣物種相關(guān)mRNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，按照TransStart Top GreenSuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）的說明書配制反應(yīng)體系并在ABI 7500 Real-Time PCR儀上進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)，每個樣品重復(fù)3次。其中，GnRH-I、GnRHR、GnIH、GnIHR、LHβ、FSHR、INHα、INHβA、LHR基因引物序列引自參考文獻(xiàn)[11]～[14]。

1.5?數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法進(jìn)行Q-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，目的基因的mRNA表達(dá)量采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法。為了縮小不同日齡數(shù)據(jù)間存在的差異，對睪丸質(zhì)量、FSHβ、LHβ、FSHR、AMH、INHα、INHβA、LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因mRNA表達(dá)量等數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化處理。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸發(fā)育和血清睪酮濃度變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨的體質(zhì)量逐漸降低并達(dá)到開產(chǎn)前標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（圖1A），其睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)急劇增加（圖1B、圖1C）。與105日齡相比，135日齡時睪丸質(zhì)量增加了10倍以上，表明此時睪丸進(jìn)入快速發(fā)育階段。組織學(xué)觀察結(jié)果表明，隨著日齡增加，睪丸曲精細(xì)管直徑和上皮生精細(xì)胞數(shù)量增加（圖2）。75～105日齡時，睪丸曲精細(xì)管上皮由單層變?yōu)殡p層，主要由支持細(xì)胞和精原細(xì)胞組成;135日齡時，睪丸曲精細(xì)管上皮變?yōu)槎鄬?，出現(xiàn)了不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞;165日齡時，睪丸曲精細(xì)管管腔中出現(xiàn)了成熟精子，表明睪丸發(fā)育達(dá)到性成熟階段。隨著睪丸發(fā)育至成熟，血清睪酮質(zhì)量濃度顯著增加（圖1D）。

2.2?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦和腦垂體組織基因表達(dá)變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦組織中GnRH-I和GnIH基因mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，但是不同日齡之間差異不顯著（圖3A、圖3B）。與135日齡相比，165日齡時腦垂體組織中GnRHR基因mRNA表達(dá)量顯著降低（圖3C）。與75日齡相比，105～165日齡時腦垂體組織中GnIHR基因mRNA表達(dá)量顯著降低（圖3D）。與105日齡相比，135日齡時腦垂體組織中FSHβ基因mRNA表達(dá)量增加了40倍以上（圖3E），表明此時睪丸進(jìn)入快速發(fā)育階段。LHβ基因與FSHβ基因的mRNA表達(dá)量變化趨勢相一致（圖3F）。

2.3?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸組織基因表達(dá)變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸支持細(xì)胞特異性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因的mRNA表達(dá)量顯著增加（圖4）。同時，睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表達(dá)量也顯著增加（圖5）。

3?討論

本研究通過組織學(xué)和Q-PCR方法分別檢測了不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸發(fā)育和生殖軸相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，自135日齡開始，在腦垂體FSH和LH刺激下，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸進(jìn)入快速發(fā)育階段，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng)。165日齡時，睪丸能夠產(chǎn)生成熟精子，表明睪丸發(fā)育達(dá)到性成熟階段。

禽類性腺發(fā)育過程受到下丘腦-腦垂體-性腺軸的內(nèi)分泌調(diào)控。當(dāng)個體生長發(fā)育至某一時間點(diǎn)，下丘腦GnRH脈沖分泌增加，引起腦垂體FSH和LH分泌增加，進(jìn)而刺激性腺發(fā)育。在本研究中，隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦GnRH-I和GnIH基因mRNA表達(dá)量無顯著變化，但是腦垂體GnIHR基因mRNA表達(dá)量顯著降低，表明GnIH活性降低與睪丸發(fā)育的啟動有關(guān)。潘建秋[15]研究報道，對育成期公雞主動免疫GnIH后，免疫組GnIH活性降低，腦垂體LHβ基因mRNA表達(dá)量增加，促進(jìn)睪丸發(fā)育。與105日齡相比，135日齡時腦垂體FSHβ和LHβ基因mRNA表達(dá)量顯著增加，推測這是由于GnIH活性降低所導(dǎo)致的。

135日齡開始，在高濃度FSH的刺激下，睪丸支持細(xì)胞和精原細(xì)胞快速增殖并發(fā)生分化，導(dǎo)致曲精細(xì)管直徑增加，最終表現(xiàn)為睪丸質(zhì)量增加。同時，在高濃度LH的刺激下，睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮能力增強(qiáng)，具體表現(xiàn)為LHR、StAR、CYP11A1和3β-HSD等睪酮合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量顯著增加[16]。165日齡時，睪丸曲精細(xì)管中可見成熟精子，表明睪丸發(fā)育達(dá)到性成熟階段。此時，腦垂體FSHβ基因mRNA表達(dá)量顯著降低，這可能是睪丸支持細(xì)胞分泌的高濃度抑制素A負(fù)調(diào)控腦垂體FSH分泌的結(jié)果。在哺乳動物中，研究人員發(fā)現(xiàn)AMH能夠直接作用于腦垂體調(diào)控FSH和LH分泌[17-18]，但在禽類中尚未有相關(guān)報道。在本研究中，165日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸AMH基因高表達(dá)是否與腦垂體FSHβ、LHβ基因mRNA表達(dá)量下調(diào)有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

與中國地方蛋用型鴨相比，櫻桃谷鴨（肉用型）種鴨體型大，性成熟時間晚[19]。姚遠(yuǎn)等[20]研究報道，連城白鴨90日齡時睪丸曲精細(xì)管中可見成熟精子。在本研究中，櫻桃谷鴨種公鴨135日齡時睪丸曲精細(xì)管中尚未見成熟精子，比連城白鴨遲45 d以上?；谥煸品业萚21]的研究結(jié)果，血清LH濃度的顯著增加與性腺組織的快速發(fā)育相一致，本研究推測櫻桃谷鴨種公鴨腦垂體FSH和LH分泌量增加的時間晚于連城白鴨，因此性成熟時間被延遲。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）