徐楊林，嚴宏孟，高蕾，伊力夏提·艾熱提，靳紅，周建中

（新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830000）

杏原產(chǎn)于我國，有文獻記載的栽培時間就有4000多年之久[1]，主要集中在我國的北方各地，以新疆、吉林、遼寧、山東、陜西地區(qū)最多[2]。仁用杏根據(jù)口味差別又可分為甜杏仁和苦杏仁兩種[3]?？嘈尤矢缓椭?，雖然無異味，但是味較苦[4]，我國苦杏仁產(chǎn)量豐富，但是未充分發(fā)揮苦杏仁加工增值率優(yōu)勢[5]。據(jù)統(tǒng)計[6]，絕大多數(shù)苦杏仁沒有得到高效的利用，將苦杏仁進行加工、提取的方式，提高苦杏仁資源的利用價值[7]。

多肽具有大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸所不具備的生物學功能[8]，具有抗氧化活性，且更容易被人體吸收[9]?？寡趸氖堑鞍踪|(zhì)被水解釋放后，表現(xiàn)出抑制、延緩脂質(zhì)氧化等抗氧化活性的物質(zhì)[10]。石寧蕙[11]等人對甜杏仁粕蛋白酶解動力學特性進行了研究，揭示了水解度與生物活性的關(guān)系。劉媛[12]等以杏仁粕為原料，研究了不同蛋白酶種類，加酶量，時間，溫度等因素對水解度和DPPH自由基清除率的影響。代晨曦[13]等人采用響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶酶解杏仁蛋白工藝條件。目前主要以堿法和酶法兩種方式提取多肽，但是堿法提取會多肽理化性質(zhì)改變[14]，酶法提取則具有反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好[15]。

本文通過研究苦杏仁醇溶蛋白酶解抗氧化肽的制備工藝，拓展苦杏仁在食品中的利用途徑，根據(jù)文獻可知[16]，醇溶蛋白酶解產(chǎn)物普遍具有較高的抗氧化性；為避免蛋白質(zhì)資源浪費，效果較差，對醇溶蛋白酶解工藝進行研究以提高苦杏仁蛋白精準利用，增加蛋白質(zhì)的利用率，同時為苦杏仁蛋白在食品中的利用途徑進行了探索，為苦杏仁蛋白在食品中的應(yīng)用提供了參考。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料

苦杏仁蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)93%），實驗室自制；木瓜蛋白酶（≥20000 U/g），生物酶制劑有限公司；堿性蛋白酶（≥20000 U/g），生物酶制劑有限公司；風味蛋白酶（≥20000 U/g），生物酶制劑有限公司；透析袋（截留分子量300），索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、過硫酸鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；B-1A磁力攪拌器，山東高密彩虹分析儀器有限公司；儀表恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司；FA220B分析天平，上海精科天美科學儀器有限公司；pHS-3C pH測定儀，上海理達儀器廠；LCJ-10D冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；渦旋振蕩器，江蘇金儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦杏仁醇溶蛋白的制備

參考Osborne方法[17]，對蛋白質(zhì)進行分級，制備醇溶蛋白。

1.2.2 單因素試驗

醇溶蛋白用蒸餾水進行溶解，配置成4%（W/V）的蛋白溶液，調(diào)節(jié)酶最適的溫度，預(yù)熱10 min，使用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至反應(yīng)pH，在最適條件下進行酶解。酶解條件如表1所示，酶解過程中每30 min調(diào)節(jié)一次pH，酶解結(jié)束后迅速放入恒溫95 ℃的水浴鍋中，滅酶15 min，終止反應(yīng)[18]。

表1 五種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymolysis conditions for five proteases

1.2.3 苦杏仁醇溶蛋白酶解條件優(yōu)化

選擇抗氧化活性最優(yōu)的一組蛋白酶進行優(yōu)化，主要優(yōu)化條件如下：酶添加量（3000、4000、5000、6000、7000 U/g），酶解pH（6、7、8、9、10），底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%）和酶解時間（1、2、3、4、5 h），分析以上四個因素對抗氧化活性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，以水解度（DH%）、DPPH自由基清除率兩個指標為響應(yīng)值，對顯著性影響因素進行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)的苦杏仁醇溶蛋白酶解工藝，依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對酶添加量、pH、底物濃度、酶解時間四個因素進行單因素試驗。以單因素試驗為基礎(chǔ)，確定出響應(yīng)面的因素和水平。

1.2.5 水解度（DH%）測定

采用甲醛電位滴定法[19]測定蛋白質(zhì)水解度。取20 mL滅酶酶解液，根據(jù)酶解液pH使用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至pH 8.2，加入甲醛20 mL，用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至pH 9.2，記錄所消耗的氫氧化鈉的體積（V1），以蒸餾水作為空白試驗，計算多肽液中氨基氮的含量。氨基氮計算公式如下：

式中：V1：樣品稀釋液加入甲醛后消耗NaOH標準溶液體積，mL；V2：空白試白試驗加入甲醛消耗NaOH標準溶液體積，mL；V3：樣品稀釋取用量，mL；0.014:1 mL濃度的1.0 mol/L NaOH標準溶液相當于氮的含量；m：稱取樣品的質(zhì)量，g。

水解度計算公式如下：

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定

將酶解液取0.5 mL加入試管中，再加入3.5 mL 0.5 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后在37 ℃水浴并避光的條件下反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光值（OD），以乙醇溶液作為空白對照，平行測定3次取平均值。自由基清除率公式如下：

式中：Ai：樣品DPPH試劑混合液的吸光值；Aj：樣品與乙醇試劑混液的吸光值；A0：DPPH試劑與乙醇試劑混合液的吸光值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2018軟件進行數(shù)據(jù)制圖，采用Design Expert 12進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析，每一組試驗對其待測指標測定三次，取平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 蛋白酶的優(yōu)選

不同的蛋白酶在酶解的過程中，對最終產(chǎn)物的功能效果影響會產(chǎn)生不同的影響[20]，以水解度和DPPH自由基清除率為指標，考察五種蛋白酶對苦杏仁醇溶蛋白的酶解效果，由圖1可知，在各種蛋白酶最優(yōu)條件下，堿性蛋白酶DPPH自由基清除率在95%以上，DH則在13%~14%之間，風味、中性、木瓜和胃蛋白酶DPPH自由基清除率在12%~80%之間，DH在5%~12%之間，因此選擇堿性蛋白酶作為后續(xù)酶解的工具酶。

圖1 不同蛋白酶對苦杏仁醇溶蛋白的酶解效果Fig.1 The enzymatic effect of different proteases on the prolamin

2.2 酶解工藝及抗氧化能力單因素試驗

2.2.1 酶添加量對水解度和抗氧化能力的影響

由圖2可知，隨著酶添加量增加，酶的水解作用逐漸增強，酶解液的DH%也逐漸升高，DPPH自由基清除率與DH%存在正相關(guān)關(guān)系。當加酶量在3000 U/g~5000 U/g時，酶解液的DH%與自由基清除率隨著加酶量的增加而迅速升高，當酶添加量達到5000 U/g時，DH%與自由基清除率達到最高，若酶添加量繼續(xù)增加，則出現(xiàn)了輕微的酶抑制作用，導(dǎo)致DH%出現(xiàn)下降的趨勢。根據(jù)酶動力學原理，酶的用量過少不利于水解，過多不僅水解效果差[21]，還會造成一定程度上的資源浪費。綜合考慮酶的作用效果與經(jīng)濟成本，故選取酶添加量在5000 U/g左右。

2.2.2 底物濃度對水解度和抗氧化能力的影響

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，酶解液的DH%和DPPH自由基清除率不斷升高，底物濃度達到3%時，繼續(xù)增加底物濃度，DH%的增加逐漸減弱，而自由基清除率在底物濃度為3%時達到最高點，繼續(xù)增加底物濃度，由于底物濃度過大，導(dǎo)致酶水解產(chǎn)生抑制，無法高效的進行水解作用，自由基清除率出現(xiàn)下降趨勢。由此可以看出，底物濃度在3%較為合適，故選取底物濃度為3%左右。

圖3 底物濃度對苦杏仁醇溶蛋白酶解的影響Fig.3 The effect of substrate concentration on the proteolysis of amygdalin

2.2.3 pH對水解度和抗氧化能力的影響

根據(jù)圖4可知，pH在6~10的范圍內(nèi)，酶解液的DH%和DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當pH達到9時，DH%與自由基清除率達到最高，當pH達到10時，DH%與自由基清除率出現(xiàn)下降的趨勢，由此可以看出，當?shù)鞍踪|(zhì)水解得到過程中，過酸過堿的環(huán)境都會破壞蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)[22]，導(dǎo)致水解能力下降，因堿性蛋白酶在堿性環(huán)境中的效果較好，但不宜過堿，故選取水解pH在9左右。

圖4 pH對苦杏仁醇溶蛋白酶解的影響Fig.4 The effect of pH on the proteolysis of amygdala

2.2.4 溫度對水解度和抗氧化能力的影響

由圖5可知，溫度在40 ℃~55 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，DH%與自由清除率也隨之增大，且溫度在55 ℃時達到最高，當溫度超過55 ℃時，酶解液的DH%和自由基清除率出現(xiàn)明顯的下降趨勢，這是由于當溫度達到一定程度會導(dǎo)致蛋白酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解離，導(dǎo)致蛋白酶變性[23]，從而使酶活性降低，導(dǎo)致水解作用減弱，結(jié)合試驗結(jié)果，決定蛋白酶酶解最佳水解溫度為55 ℃。

圖5 酶解溫度對苦杏仁醇溶蛋白酶解的影響Fig.5 The effect of enzymolysis temperature on the proteolysis of Amygdalus

2.2.5 時間對水解度和抗氧化能力的影響

由圖6可知，水解時間為1 h~3 h時，酶解液的DH%和自由基清除率隨著時間的增加而升高，并在3 h后逐漸趨于平穩(wěn)，在水解時間為3 h時，酶解液的DH%與自由基清除率達到最高值，這是由于水解產(chǎn)物與底物之間形成了抑制現(xiàn)象所引起[24]，以致DH%與自由基清除率無增加趨勢，綜合考慮DH%、自由基清除率與水解時間成本，故選取水解時間在3 h左右。

圖6 酶解時間對苦杏仁醇溶蛋白酶解的影響Fig.6 The effect of enzymolysis time on the proteolysis of amygdala

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，利用Design Expert 8.0.6軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3，表4。

表2 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平及編碼表Table 2 Response surface design test factor level and coding table

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析（水解度）Table 3 Analysis of variance of response surface test results (degree of hydrolysis)

利用Design Expert對表1 DH%與自由基清除率進行非線性擬合，方程如下。

水解度二次多項回歸模型方程：

DPPH自由基清除率二次多項回歸模型方程：

由Design Expert軟件進行回歸及方差分析，見表3、表4。對數(shù)學模型進行方差分析，結(jié)果表明模型的總回歸也極顯著（p<0.01），決定系數(shù)R2分別為0.9515、0.9724，說明該模型在試驗范圍內(nèi)擬合度較高，對數(shù)學模型進行失擬檢驗，顯示失擬性不顯著（p>0.05），說明該模型在試驗范圍內(nèi)擬合度也是比較高。對該數(shù)學模型的回歸系數(shù)檢驗可知：水解度結(jié)果方差分析中，pH與底物濃度對試驗的影響極顯著（p<0.01）。通過F值的大小判斷可得各個因素對苦杏仁醇溶蛋白水解度影響力為XC>XD>XB>XA，即pH>底物濃度>酶添加量>時間。DPPH自由基清除率結(jié)果方差分析中，pH與底物濃度對試驗的影響極顯著（p<0.01），時間與酶添加量對試驗的影響顯著（p<0.05），通過F值的大小判斷可知各因素影響力XD>XC>XA>XB，即底物濃度>pH>時間>酶添加量。

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析（DPPH自由基清除率）Table 4 Analysis of variance of response surface test results (DPPH free radical scavenging rate)

2.3.1 水解度的因素交互效應(yīng)分析

從圖7可看出，三維圖總體趨勢為向上凸起，說明該數(shù)學模型具有最大值。利用Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進一步分析，并對擬合的回歸方程進行計算，理論水解度最大為26.75%，實際測得的結(jié)果為26.74%±0.54%，軟件在該點的估計值為26.75%與預(yù)測值相比，誤差僅為0.1%接近預(yù)測值，表明在該試驗?zāi)Ｐ拖碌玫降淖罴压に嚄l件具有較高的可靠性，可以用于預(yù)測苦杏仁醇溶蛋白酶解最終的水解度。

圖7 各因素交互作用對苦杏仁醇溶蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the effect of each factors interaction on the degree of hydrolysis of amygdalin

2.3.2 自由基清除率的因素交互效應(yīng)分析

根據(jù)圖8中6組響應(yīng)面及等高線的形狀來分析酶添加量、酶解pH、酶解溫度和酶解時間四個主要因素間的交互作用對苦杏仁多肽DPPH自由基清除率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自由基清除率響應(yīng)值呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，酶添加量與pH（BC）、酶解時間與底物濃度（AD）交互作用與其他幾組相比更強。

圖8 各因素交互作用對苦杏仁醇溶蛋白DPPH自由基清除率的影響Fig.8 The effect of the interaction of each factors interaction on the scavenging rate of DPPH free radical of amygdalin

根據(jù)圖8可知，三維圖總體趨勢為向上凸起，說明該數(shù)學模型具有最大值。預(yù)測苦杏仁醇溶蛋白酶解多肽的最佳工藝條件當預(yù)測最優(yōu)工藝條件為時間：4.121 h、酶添加量5208.930 U/g、底物濃度3.21%、pH 9.22，理論自由基清除率最大為98.02%，由于實驗條件限制，將該條件修訂為酶添加量為5000 U/g，pH為9，底物濃度為3%，酶解時間為4 h時，對該條件進行驗證試驗，實際測得的結(jié)果為97.86%±0.58%，軟件在該點的估計值為98.02%與實測值相比，誤差僅為0.16%，接近預(yù)測值，可以用于預(yù)測苦杏仁醇溶蛋白酶解的工藝條件。

根據(jù)文獻可知，劉媛[12]等人通過響應(yīng)面法優(yōu)化了杏仁粕酶解工藝，研究其酶解液的抗氧化活性，其最終水解度與DPPH自由基清除率分別為29.36%和86.16%，與本文的研究相比較，水解度優(yōu)化程度相差2.61%，但是本文的DPPH自由基清除率優(yōu)化程度明顯優(yōu)于對方，高出11.7%。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化了苦杏仁醇溶蛋白抗氧化肽的制備工藝。通過響應(yīng)面分析可知，酶解時間、pH、底物濃度，酶添加量都對水解度和自由基清除率存在影響，最終通過軟件得到優(yōu)化酶解條件為時間4 h，酶添加量5000 U/g，底物濃度3%，pH 9，此時苦杏仁醇溶蛋白的水解度與DPPH自由基清除率均為最高，通過驗證試驗實際測得水解度與DPPH自由基清除率分別26.74%±0.54%與97.86%±0.58%，與預(yù)測值相差較小，證明此響應(yīng)面可以準確地預(yù)測苦杏仁醇溶蛋白酶解抗氧化肽最優(yōu)工藝。本研究結(jié)果可以為苦杏仁在食品工業(yè)上的實際運用提供參考。