劉慧，曾祥權(quán)，謝文東，蔣世衛(wèi)，杜洪淼，周玉春，黃華

（1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，北京 101300）（2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

李斯特菌屬革蘭氏陽性短桿菌，兼性厭氧、無芽孢、一般不形成莢膜[1]。迄今為止，已經(jīng)分離并鑒定出17種李斯特菌菌株，代表菌株有單增李斯特菌（L.monocytogenes）、綿羊李斯特菌（L. iuanuii）、西爾李斯特菌（L. seeligeri）、英諾克李斯特菌（L.innocua）、威爾斯李斯特菌（L. welshimeri）、格氏李斯特菌（L.grayi）等[2]，其中單增李斯特菌可直接引起人類李斯特菌病[3]。單增李斯特菌作為一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于新鮮果蔬、乳制品、肉制品、水產(chǎn)品、冷凍冷藏食品及即食食品等各種食品中[4]，并在低溫、酸性、厭氧、高鹽等不利的生存環(huán)境下仍能生長，還可以在食物接觸表面（如不銹鋼）進(jìn)行擴(kuò)散，并在生物膜的保護(hù)下，耐受高濃度的消毒劑和抗菌劑[5,6]。值得注意的是，食品中單增李斯特菌的污染可能發(fā)生在生產(chǎn)、加工、包裝或分銷等任何一個(gè)環(huán)節(jié)。

國內(nèi)外關(guān)于單增李斯特菌引起的食物中毒事件頻頻發(fā)生[7-9]。李斯特菌病的高危人群是孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫功能障礙者[10]，其有非侵入性和侵入性兩種臨床表現(xiàn)。非侵入性臨床表現(xiàn)為較輕的食物中毒癥狀，如發(fā)燒、頭痛和腹瀉，醫(yī)學(xué)上稱之為發(fā)熱性腸胃炎；而侵入性疾病包括腦膜炎、腦炎、敗血癥及圍產(chǎn)期感染，可誘發(fā)早產(chǎn)、流產(chǎn)、甚至死產(chǎn)[11]。盡管與其他常見的食源性疾病如沙門氏菌病或大腸桿菌感染疾病相比，李斯特菌病的發(fā)生率較低，但其致死率高達(dá)20%~30%[12-14]，這意味著巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和公共衛(wèi)生威脅。另外，99%的李斯特菌病例是由于食用了被單增李斯特菌污染的食品所致[15]。特別是近年來隨著消費(fèi)者生活習(xí)慣和方式的改變，即食食品的消費(fèi)量逐年增加。由于其無需清洗或烹調(diào)處理即可直接食用的特點(diǎn)，更易被微生物污染，同時(shí)也加大了公眾對(duì)單增李斯特菌的暴露風(fēng)險(xiǎn)[16]。

鑒于單增李斯特菌對(duì)經(jīng)濟(jì)和公共安全的嚴(yán)重危害，很多國家和組織對(duì)單增李斯特菌污染問題日益關(guān)注和重視，并對(duì)食品中的單增李斯特菌的限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。歐盟委員會(huì)2073/2005號(hào)法規(guī)（歐洲委員會(huì)，2005）[17]規(guī)定嬰幼兒即食食品與特殊醫(yī)療用途的即食食品，在其產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)對(duì)單增李斯特菌實(shí)施“零容忍”政策，即25 g內(nèi)不得檢出（0/25 g）；對(duì)于其他類的無法支持單增李斯特菌生長的即食食品，在其產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)單增李斯特菌的限量為100 CFU/g；對(duì)于其他類的可以支持單增李斯特菌生長的即食食品，單增李斯特菌的限量標(biāo)準(zhǔn)要根據(jù)食物鏈水平確定。在美國，食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定對(duì)于不支持單增李斯特菌生長的即食食品，單增李斯特菌含量應(yīng)小于100 CFU/g[18]。在我國，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品（預(yù)包裝食品，不包括罐頭類食品）中不得檢出單增李斯特菌[19]。

目前，我國對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法為主，該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌，并通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，操作復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)周期長且靈敏度不高。因此，迫切需要探索更加快速、便捷、準(zhǔn)確、安全的檢測(cè)技術(shù)，這對(duì)實(shí)現(xiàn)在整個(gè)食物鏈中單增李斯特菌的實(shí)時(shí)監(jiān)控，及時(shí)有效預(yù)防單增李斯特菌誘發(fā)的食源性疾病及維護(hù)公共健康衛(wèi)生，減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前已經(jīng)開發(fā)使用的單增李斯特菌快速檢測(cè)方法主要有基于抗原/抗體特異性結(jié)合的免疫分析法、基于分子生物學(xué)的核酸分析法、新型生物傳感器法及基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等[15,20-23]，這些快速檢測(cè)技術(shù)能夠大大提高單增李斯特菌的檢測(cè)效率和靈敏度。本文就傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及新興快速檢測(cè)在單增李斯特菌中的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)闡述，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了討論分析，以期為相關(guān)工作者針對(duì)單增李斯特菌的快速檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

平板培養(yǎng)法是用于單增李斯特菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法，檢出限通常為1~5 CFU/25 g樣品[24]。由于單增李斯特菌易受加熱、冷凍、冷凍干燥、鹽、防腐劑及其他化學(xué)添加劑或天然抑菌化合物等因素的傷害而處于亞致死狀態(tài)，導(dǎo)致其很難被傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢出[25]。此外，即便是單增李斯特菌活菌，也可通過進(jìn)入休眠狀態(tài)以應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力，休眠狀態(tài)下的活菌細(xì)胞仍具有存活能力，但其在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上不可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBCN）[26]。鑒于單增李斯特菌具有亞致死損傷和VBCN狀態(tài)，針對(duì)其檢測(cè)的培養(yǎng)方法通常包括兩步富集過程。采用非選擇性或半選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行的預(yù)富集步驟可以使受傷的目標(biāo)生物體復(fù)蘇并增殖，同時(shí)該步驟還可稀釋抑菌物質(zhì)并對(duì)來自干燥或加工食品基質(zhì)中的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行水化作用[27]；采用選擇性培養(yǎng)基（如含不同鹽類和抗生素）進(jìn)行的富集步驟可抑制背景菌群生長，并對(duì)目標(biāo)病原體進(jìn)行選擇性增殖，增殖倍數(shù)可達(dá)百萬倍以便于其分離檢測(cè)[24]。通過對(duì)分離菌落進(jìn)行染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)等可得出定性檢測(cè)結(jié)果。目前我國常用的方法主要是國標(biāo)法（GB 4789.30-2010），其采用的平板培養(yǎng)法靈敏度高，成本低，可給出定性和定量結(jié)果，但操作步驟多，過程較復(fù)雜，從培養(yǎng)得到可疑菌落到檢測(cè)得出確定結(jié)果，整個(gè)周期需要5~14 d[28]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)病原體的方法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)方法，可靠、準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長，不適用于緊急狀態(tài)下的快速檢測(cè)。近年來，不斷有研究對(duì)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法進(jìn)行改進(jìn)，如在選擇性培養(yǎng)基中使用熒光或顯色底物，可避免傳代培養(yǎng)和生化鑒定，使得分析更加快捷便利[29,30]。

2 免疫測(cè)定方法

免疫學(xué)測(cè)定方法以病原微生物作為免疫原，制備相應(yīng)的特異性抗體，通過抗原抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。一個(gè)單克隆抗體可以識(shí)別一個(gè)特定抗原，而一個(gè)多克隆抗體可以識(shí)別一個(gè)或多個(gè)抗原。針對(duì)單增李斯特菌的免疫測(cè)定方法的檢測(cè)限（約103~107CFU/mL）受抗體和免疫試驗(yàn)類型的影響。為了達(dá)到設(shè)定的檢測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)，免疫測(cè)定時(shí)通常需要對(duì)樣品進(jìn)行富集。在食品診斷中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）、酶聯(lián)熒光分析法（Enzyme-linked fluorescent，ELFA）、側(cè)向免疫層析法（Lateral flow immunoassay，LFI）和免疫磁性分離法（Immuno-magnetic separation，IMS）等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

在ELISA中，預(yù)先將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面上，然后與待測(cè)樣品中的抗體或抗原分子發(fā)生特異性結(jié)合，得到的免疫復(fù)合物所攜帶的酶可與特定底物相反應(yīng)發(fā)生顏色變化。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，ELISA方法檢測(cè)時(shí)間短，大約30~50 h即可得出結(jié)果。但是，只有當(dāng)病原體的數(shù)量足夠多時(shí)，免疫檢測(cè)才能提供有效的信息。因此，ELISA方法檢測(cè)靈敏度較低，大約在105~106CFU/mL之間，且抗體對(duì)病原體的親和力低，易受污染物等因素的干擾。免疫分析可以多種形式進(jìn)行，通常采用的是夾心“三明治”反應(yīng)類型，從而進(jìn)一步減少分析時(shí)間、試劑和樣品量[31-33]。Magliulo等[34]人開發(fā)了一種可同時(shí)檢測(cè)包括單增李斯特菌在內(nèi)的多種病原菌的夾心ELISA方法，在該測(cè)定中靶標(biāo)病原菌的特異單克隆抗體被固定在96孔微量滴定板中，一旦待測(cè)樣品中的抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，就添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體，并通過測(cè)定魯米諾底物的化學(xué)發(fā)光來測(cè)量酶活。該方法對(duì)所有靶標(biāo)病原菌的定量限在104~105CFU/mL之間，測(cè)定前樣品需要進(jìn)行富集。Portanti等[35]采用ELISA方法測(cè)定了包括肉品、海產(chǎn)品和乳制品在內(nèi)的220個(gè)污染樣品中的單增李斯特菌，該方法得到ISO標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證，加標(biāo)樣品的檢測(cè)限為6.6×103CFU/mL，相對(duì)檢測(cè)限為5~10 CFU/g。夾心ELISA法操作簡單，特異性強(qiáng)，反應(yīng)靈敏度高。然而，制備單克隆抗體的成本較高，使得采用ELISA試劑盒測(cè)試各種食物樣品的成本相對(duì)較高。

2.2 酶聯(lián)免疫熒光分析法（ELFA）

ELFA是將熒光物標(biāo)記到抗體上，單增李斯特菌抗原和單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度檢測(cè)單增李斯特菌的數(shù)量，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。Ueda等[36]使用一種基于ELFA原理的商品化檢測(cè)方法（VIDAS?LMO2）以測(cè)定食品樣品中的單增李斯特菌，該方法在弱酸性食物樣品中的檢測(cè)限為105CFU/mL，在酸奶和果汁等酸性食物樣品中的檢測(cè)限為106CFU/mL，且有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，大約70 min即可獲得結(jié)果。ELFA中無顯色反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間短，且靈敏度高于ELISA；但缺點(diǎn)是成本較高，目前主要應(yīng)用于自動(dòng)ELFA系統(tǒng)（VIDAS）。

2.3 側(cè)向免疫層析法（LFI）

側(cè)向免疫層析（LFI）是在免疫滲透技術(shù)基礎(chǔ)上建立的固相標(biāo)記分析技術(shù)，結(jié)合了免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。LFI的物化形式是免疫層析試紙條，核心部分由樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)墊、支撐墊和吸水墊五部分組成（如圖1所示）。在毛細(xì)管作用下，抗原與抗體在硝酸纖維素膜等固相載體上發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，利用標(biāo)記材料的顯色作用或熒光效應(yīng)，可通過肉眼直接觀察檢測(cè)條帶或在熒光激發(fā)狀態(tài)下測(cè)量熒光強(qiáng)度得到定性定量分析結(jié)果[37]。目前有膠體金、熒光素、量子點(diǎn)等多種標(biāo)記材料。該方法靈敏度高、對(duì)操作人員要求低，并且不需要昂貴的儀器設(shè)備，易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，主要作為定性或半定量篩選手段。Cho等[38]基于單克隆單增李斯特菌抗體LZF7和LZH1開發(fā)的LFI方法與磁處理聯(lián)合使用以檢測(cè)人工接種牛奶中的單增李斯特菌，檢測(cè)可在2 h內(nèi)完成，檢測(cè)限低至102CFU/mL。Bla?kova等[39]利用LFI方法檢測(cè)經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）得到的擴(kuò)增樣品中的單增李斯特菌基因，將PCR產(chǎn)物加入LFI檢測(cè)設(shè)備中，特異性擴(kuò)增子的存在會(huì)顯示為一條暗線，檢測(cè)時(shí)間為28 h（包括24 h的富集時(shí)間），檢測(cè)結(jié)果為<10個(gè)細(xì)胞/25 mL樣品；Kovacevic等[40]將LFI方法應(yīng)用于肉類生產(chǎn)加工不同階段的環(huán)境樣品中單增李斯特菌的檢測(cè)，研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR測(cè)定相比，LFI同樣具有特異性，且大批量檢測(cè)樣品時(shí)（>300個(gè)）依然具有較高的靈敏度。

圖1 側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l示意圖Fig.1 Schematic diagram of lateral flow test strip

2.4 免疫磁性分離法（IMS）

免疫磁性分離法又稱為免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）分離技術(shù)，該技術(shù)是對(duì)具有超順磁性的微粒表面進(jìn)行化學(xué)修飾，使之可與特異性抗體發(fā)生結(jié)合，成為能夠捕獲特異性抗原的磁珠。將免疫磁珠與待測(cè)溶液混合，若有靶標(biāo)抗原存在，即被免疫磁珠捕獲，形成抗原-免疫磁珠復(fù)合物，并在適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)條件下發(fā)生分離，從而達(dá)到富集靶標(biāo)抗原的目的[41]，如圖2[46]所示。該技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，分離富集速度快，適用范圍廣。在實(shí)際應(yīng)用中，該方法通常與ELISA技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光信號(hào)技術(shù)等聯(lián)合使用以改進(jìn)和增強(qiáng)方法的靈敏度。Yang等[42]采用單增李斯特菌單克隆抗體、免疫磁珠分離技術(shù)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，建立乳品中單增李斯特菌的納米免疫磁分離-實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)限為>102CFU/0.5 mL。Wang等[43]將納米免疫磁分離技術(shù)與量子點(diǎn)熒光分析相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)2 h內(nèi)同時(shí)靶向檢測(cè)食物樣品中的單增李斯特菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，該方法在碎牛肉、雞肉、西藍(lán)花和生菜樣品中的檢測(cè)限為20~50 CFU/mL。Walcher等[44]將順磁珠表面涂上重組單增李斯特菌噬菌體內(nèi)溶素產(chǎn)生的細(xì)胞壁結(jié)合域蛋白（cell wall-binding domain proteins，CBD），形成的CBD磁珠用于原奶中單增李斯特菌的檢測(cè)，該方法的靈敏度為102~103CFU/mL。Amagliani等[45]人開發(fā)了一種更為靈敏的多重磁珠捕獲雜交-三重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)海產(chǎn)品中的單增李斯特菌和沙門氏菌，該方法的檢測(cè)限為1 CFU/g。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 常規(guī)PCR

PCR技術(shù)通過對(duì)單增李斯特菌的特異性目標(biāo)基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并用于擴(kuò)增這一段基因，從而獲得大量待測(cè)基因以確證為單增李斯特菌。常見的目標(biāo)基因有hly，inlA，inlB、iap、16S和23S rRNA以及編碼入侵相關(guān)蛋白p60、氨肽酶C、磷脂酶C蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白和dth-18延遲型超敏蛋白的基因[47,48]。PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好且操作簡便，被廣泛應(yīng)用于食品中單增李斯特菌的檢測(cè)。常規(guī)的定性或半定量PCR依賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的終點(diǎn)分析（電泳或熒光）。Amagliani等[49]采用商品化DNA提取試劑盒與常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)人工接種并富集24 h后的豬肉香腸和馬蘇里拉奶酪中的單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，方法靈敏度可達(dá)1 CFU/g。Delibato等[50]將PCR技術(shù)與微流控芯片電泳系統(tǒng)結(jié)合對(duì)即食肉制品、奶酪、煙熏三文魚等食物樣品中的單增李斯特菌檢測(cè)，該方法與ISO標(biāo)準(zhǔn)方法檢出結(jié)果一致。但是，PCR技術(shù)無法區(qū)分DNA是來自死細(xì)胞還是活細(xì)胞，往往會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果[51]。為了避免死菌DNA造成的假陽性結(jié)果，可將疊氮溴乙錠（EMA）和疊氮溴化丙啶（PMA）與PCR聯(lián)合使用[52]。PMA和EMA不能穿透活菌，但很容易進(jìn)入細(xì)胞膜受損的死菌細(xì)胞并與其DNA分子結(jié)合，導(dǎo)致DNA分子無法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而可用PCR技術(shù)將死活菌區(qū)分開。還可使用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，與DNA相比，mRNA的半衰期更短，在細(xì)胞死亡之后降解更快，因此可以作為有用的目標(biāo)分子以檢測(cè)樣本中存在的活細(xì)胞[53]。然而，當(dāng)選擇毒力因子mRNAs作為目標(biāo)分子時(shí)，必須認(rèn)識(shí)到這些mRNAs有時(shí)只在特定環(huán)境條件下表達(dá)。而且，在不受DNA干擾情況下提取mRNA是一個(gè)繁瑣的過程[54]。近年來，還有研究開發(fā)出過濾技術(shù)，能夠從活細(xì)胞中快速清除死亡和受損細(xì)胞[55]。此外，單增李斯特菌是一種低細(xì)胞數(shù)量細(xì)菌[20]，有研究發(fā)現(xiàn)濃縮肉湯中英諾克李斯特菌（L.innocua）的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單增李斯特菌[48]，從而導(dǎo)致單增李斯特菌很難被檢出，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。目標(biāo)DNA的缺失或濃縮食品中酚類物質(zhì)、核酸酶等抑制劑的存在，也會(huì)造成假陰性結(jié)果。因此，許多研究將內(nèi)參（Internal control，IAC）DNA片段添加到反應(yīng)管中與目標(biāo)DNA同時(shí)擴(kuò)增以檢測(cè)PCR抑制劑是否存在，辨別假陰性。Rip等[56]以hly基因?yàn)榘袠?biāo)基因，并對(duì)內(nèi)參基因IAC進(jìn)行優(yōu)化，建立的PCR方法用于檢測(cè)人工接種并富集22 h的卡門培爾奶酪和鴕鳥肉樣品中的單增李斯特菌。

3.2 多重PCR（Multiplex PCR，mPCR）

多重PCR檢測(cè)是在一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中加入多組引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。操作過程與反應(yīng)試劑與常規(guī)PCR相同，特異性增強(qiáng)，可同時(shí)檢測(cè)不同食源性病原體，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測(cè)[57]。Chen等[21]通過比較基因組學(xué)方法篩選出50個(gè)ST121菌株的候選基因，從中選擇靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)該菌株特異性引物，并以prfA基因設(shè)計(jì)單增李斯特菌的特異性引物，基于此開發(fā)建立了一種用于鑒定單增李斯特菌ST121菌株的多重PCR方法。該方法快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，檢測(cè)限為253 fg/μL基因組，將其用于人工接種牛奶（富集4~12 h）中ST121菌株的檢測(cè)，靈敏度達(dá)到2.5~2.5×104。Zhang等[58]采用基于微芯片電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光的多重PCR技術(shù)用于測(cè)定單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌，該方法分析時(shí)間短，試劑用量少，選擇性強(qiáng)，靈敏度高。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，可在135 s內(nèi)分離出三種致病菌的PCR產(chǎn)物，其中單增李斯特菌的檢測(cè)限為1.8 ng/μL；將該方法用于人工接種牛奶中三種致病菌的檢測(cè)，單增李斯特菌的靈敏度為68 CFU/mL。Rawool等[59]開發(fā)了一種新穎的多重PCR方法用以鑒定李斯特菌屬，并區(qū)分單增李斯特菌及其主要譜系（LI，LII，LIII），該方法快速、廉價(jià)，可用于篩選和鑒定單增李斯特菌的亞型分型。然而，與常規(guī)PCR使用單個(gè)引物相比，多重PCR引物之間易發(fā)生相互干擾，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低[60]。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入特定熒光物質(zhì)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。熒光強(qiáng)度的變化取決于累積的PCR產(chǎn)物的量，通過監(jiān)測(cè)其變化可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)進(jìn)程并進(jìn)行定量分析[61]。反應(yīng)體系中加入的熒光分子可以使標(biāo)記有熒光染料以及猝滅劑的特異性探針，如TaqMan探針、分子信標(biāo)、蝎子引物、雙雜交探針及復(fù)合探針等，也可以是非特異性DNA結(jié)合染料，如SYBR Green I。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR的特異性較強(qiáng)，靈敏度較高，操作簡便，且具有可定量的優(yōu)勢(shì)[62]。Jin等[63]根據(jù)李斯特菌的ssrA基因設(shè)計(jì)引物和探針，通過使用實(shí)時(shí)PCR和高分辨熔融曲線分析鑒定食物樣品中包括單增李斯特菌在內(nèi)的6種李斯特菌，其中單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度為102CFU/mL。Schoder等[64]分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ISO標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)76種食物樣品中的單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，相較于ISO標(biāo)準(zhǔn)方法，實(shí)時(shí)定量PCR方法的準(zhǔn)確性更高（96%），特異性更強(qiáng)（100%），靈敏度更高（76.9%）。Wei等[65]將免疫磁性分離（IMS）技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合建立了豆芽樣品中單增李斯特菌的快速檢測(cè)方法，該方法的擴(kuò)增效率為96.7%，檢測(cè)時(shí)間短（27 h），特異性強(qiáng)為（100%），靈敏度（95%）和準(zhǔn)確性（95.6%）均較高，檢測(cè)限低至4.4 CFU/g。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的特征是針對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4個(gè)不同的引物，然后再利用鏈置換型DNA聚合酶在等溫條件（60~65 ℃）下進(jìn)行擴(kuò)增，整個(gè)反應(yīng)持續(xù)1 h，最后通過肉眼觀察白色渾濁對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷[66]。與常規(guī)PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等步驟，擴(kuò)增效率極高，可在15~60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109~1010倍的擴(kuò)增，具有快速、簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[67,68]。該技術(shù)不需要專門的PCR儀器即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，其檢測(cè)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Wan等[69]根據(jù)hlyA基因設(shè)計(jì)6條引物，建立了改良單疊氮丙啶-LAMP方法用于檢測(cè)人工接種食品樣品中的單增李斯特菌，該方法在純培養(yǎng)物和食品樣品中的檢測(cè)限分別為102~3.1×103CFU/g。Mik?-Krajnik等[70]基于商品化生物發(fā)光方法（3MTM分子檢測(cè)系統(tǒng)，MDA）開發(fā)了一種新穎的LAMP方法用于檢測(cè)不銹鋼和聚乙烯表面上的三種單增李斯特菌菌株，該方法的檢測(cè)限為100~102/100 cm2，特異性和靈敏度均為100%。Feng等[68]將磁分離適配體捕獲與LAMP方法結(jié)合對(duì)17種食物樣品中的單增李斯特菌進(jìn)行分析檢測(cè)，該方法不需要預(yù)先培養(yǎng)富集，總測(cè)定時(shí)間約為3 h，檢測(cè)限低至5 CFU/mL，準(zhǔn)確性為100%。

3.5 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）

重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）是由特定的酶和蛋白組合（重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶）參與，在恒定溫度下反應(yīng)5~20 min即可實(shí)現(xiàn)微量核酸指數(shù)擴(kuò)增的新技術(shù)[71]。RPA與常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)一樣具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但反應(yīng)速度更快且不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。與其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，RPA技術(shù)所需溫度更低（37~42℃），能在廣泛環(huán)境溫度下工作，更適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前，已有RPA應(yīng)用于單增李斯特菌檢測(cè)的報(bào)道。如Du等[72]將RPA與免疫層析試紙條（lateral flow strip，LF）相結(jié)合建立了一種單增李斯特菌快速檢測(cè)方法（RPA-LF），等溫?cái)U(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)步驟可以在15 min內(nèi)完成，且具有較高的靈敏度和特異性，在純培養(yǎng)條件下檢測(cè)限低至1.5×101CFU/mL。Wang等[73]采用同樣的策略建立了一種改進(jìn)的RPA-LF方法用以檢測(cè)不同食品樣品中的單增李斯特菌，改進(jìn)后的方法靈敏度更低（10 CFU/25 g樣品），并可有效消除引物二聚體的假陽性信號(hào)。

3.6 DNA微陣列（DNA microarray）

DNA微陣列又稱為基因芯片技術(shù)，主要是將多個(gè)寡聚核苷酸序列作為探針，有序地排列在硅膠板或其他固體物質(zhì)上，與待測(cè)樣品的標(biāo)記基因進(jìn)行雜交，接著通過熒光的激光共聚檢測(cè)器對(duì)芯片進(jìn)行掃描，分析熒光信號(hào)得到檢測(cè)結(jié)果[74]。一個(gè)基因芯片上可以含有成千上萬個(gè)探針，一次同時(shí)檢測(cè)出多種致病菌。因此，DNA微陣列技術(shù)大大提高了檢測(cè)工作的效率，可實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的高通量分析，已成功應(yīng)用于多種食源性致病菌的檢測(cè)與基因分型。Volokhov等[75]將DNA微陣列技術(shù)與多重PCR擴(kuò)增相結(jié)合，開發(fā)出可用于包括單增李斯特菌在內(nèi)的6種李斯特菌同時(shí)檢出的芯片制作及檢測(cè)方法。Bang等[76]從單增李斯特菌菌株ATCC19111的基因組中隨機(jī)選出60個(gè)不同大小的DNA片段并將其固定在胺涂層玻璃載玻片上制作出探針用以對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行鑒定區(qū)分，將該探針與從單增李斯特菌菌株中提取的DNA基因組雜交，發(fā)現(xiàn)16珠單增李斯特菌的雜交信號(hào)為98%~100%，將該DNA芯片用于人工接種牛奶中單增李斯特菌的檢測(cè)，檢測(cè)限約為8 logCFU/mL。目前，在DNA微陣列檢測(cè)過程中，尚缺乏簡便有效的方法以獲得足夠量的熒光標(biāo)記DNA與探針進(jìn)行雜交，并獲得顯著的特異性陽性結(jié)果。

3.7 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

FISH是將熒光素直接或間接標(biāo)記的核酸探針與待測(cè)樣品中的核酸序列按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，經(jīng)洗滌后直接在熒光顯微鏡下觀察。Rohda等[77]對(duì)近年來應(yīng)用于食品中單增李斯特菌檢測(cè)的FISH方法進(jìn)行了綜述。Fuchizawa等[78]將過濾培養(yǎng)和FISH技術(shù)相結(jié)合，以李斯特菌的23S rRNA與單增李斯特菌的16S rRNA為探針，對(duì)人工接種的煙熏鮭魚、奶酪、火腿、卷心菜等食物樣品中的李斯特菌和單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，該方法與傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)法相比，檢測(cè)時(shí)間縮短（12~16 h），靈敏度可達(dá)到102~103CFU/mL。Moreno等[79]分別采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR方法以及基于直接活菌計(jì)數(shù)（Direct Viable Count，DVC）的FISH方法對(duì)191份新鮮蔬菜和冷凍蔬菜樣品中的李斯特菌和單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)、PCR和DVC-FISH檢測(cè)系統(tǒng)分別檢出4%、10%、33%的樣品呈陽性，而DVC-FISH相較于其他兩種方法，檢測(cè)時(shí)間更短，靈敏度更高，即培養(yǎng)7 h后，可檢出活菌細(xì)胞7.4×102~7.4×102CFU/g。

4 生物傳感器（Biosensors）

生物傳感器是一類能感應(yīng)生物反應(yīng)并將該反應(yīng)經(jīng)過信號(hào)放大轉(zhuǎn)化為可以檢測(cè)到的光、電等化學(xué)信號(hào)的分析設(shè)備，主要由生物受體（微生物、細(xì)胞、酶、核酸、抗原、抗體等）和轉(zhuǎn)換器組成，如圖3所示。轉(zhuǎn)換器可以是光學(xué)的（拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜、表面等離子體共振、光纖）、電化學(xué)的（電流、阻抗、電位、電導(dǎo)）、熱學(xué)的以及基于質(zhì)量學(xué)（壓電、磁）的[80]。由于生物傳感器在微生物快速檢測(cè)中表現(xiàn)出的優(yōu)良性能，目前也有許多研究集中在為單增李斯特菌檢測(cè)開發(fā)各種敏感的生物傳感器?；诠鈱W(xué)原理的生物傳感器是利用光學(xué)材料對(duì)適配體、抗原或抗體進(jìn)行修飾，然后通過適配體與病原體或抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，以光學(xué)材料特性的變化反映病原菌濃度的變化[81]。如Chen等[82]結(jié)合免疫磁性分離、脲酶催化和pH指示劑開發(fā)了一種光學(xué)生物傳感器可對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行快速檢測(cè)，該方法的檢測(cè)限低至1.0×102CFU/mL，將其應(yīng)用于人工接種生菜樣品中單增李斯特菌的檢測(cè)，平均回收率為95.1%。近年來電化學(xué)生物傳感器因其高靈敏度、高通用性、強(qiáng)便攜性等特點(diǎn)受到人們廣泛關(guān)注。這些傳感器依賴于核酸、抗原、抗體、適配體等的生物偶聯(lián)，將生物信號(hào)經(jīng)電子或電阻傳導(dǎo)轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的化學(xué)信號(hào)，主要類型有電流型、阻抗型及電導(dǎo)型等[83]。如Radhakrishnan等[84]將單增李斯特菌的單克隆抗體lgG1固定在Au電極上作為單增李斯特菌的檢測(cè)探針，抗體與單增李斯特菌的特異性結(jié)合引起電極表面阻抗的變化，通過免疫傳感器的電化學(xué)阻抗變化來反映單增李斯特菌的濃度，該方法可特異性地檢測(cè)未經(jīng)濃縮的人工接種番茄提取物中的單增李斯特菌，檢測(cè)靈敏度高度達(dá)4 CFU/mL。Niu等[85]利用金納米粒子（AuNPs）和部分還原氧化石墨烯（p-RGO）修飾電極構(gòu)建了檢測(cè)單增李斯特菌的hly基因序列的電化學(xué)DNA生物傳感器，以亞甲基藍(lán)為電化學(xué)指示劑，采用微分脈沖伏安法監(jiān)測(cè)目標(biāo)DNA的雜交。在最佳條件下，該方法檢測(cè)的濃度范圍為1.0×10-13~1.0×10-6mol/L，檢測(cè)限為3.17×10-14mol/L。此外，也有基于質(zhì)量學(xué)的壓電生物傳感器用于食物中單增李斯特菌檢測(cè)的報(bào)道。如Shmarma等[86]采用單增李斯特菌的商品化多克隆抗體，并使用壓電懸臂生物傳感器代替電化學(xué)傳感器檢測(cè)牛奶中的單增李斯特菌，該方法的檢測(cè)限為103細(xì)胞/mL。以上列舉的生物傳感器方法省時(shí)、簡便，但有些方法的靈敏度有待進(jìn)一步改善。

圖3 生物傳感器基本組件圖[81]Fig.3 Basic component of biosensor

5 其他快速檢測(cè)方法

5.1 飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALIDI-TOF-MS）技術(shù)具有分析時(shí)間短、試驗(yàn)成本低、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于食源性病原微生物的鑒定。工作原理是每種病原菌都具有其特征性蛋白質(zhì)指紋圖譜，細(xì)菌蛋白與樣品基質(zhì)結(jié)合后，通過激光電離提取總蛋白，并經(jīng)由檢測(cè)器被捕獲，根據(jù)不同質(zhì)荷比（m/z）的蛋白質(zhì)通過飛行管的時(shí)間不同進(jìn)行分離，最后通過與數(shù)據(jù)庫圖譜比對(duì)得出定性分析結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的鑒定和分型[87]。在2008年，Barbuddhe等[88]利用全細(xì)胞MALDI-TOF技術(shù)，通過獲得細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白的特征性指紋圖譜，對(duì)不同來源和物種水平的李斯特菌進(jìn)行鑒定。該實(shí)驗(yàn)中，首先從純培養(yǎng)板中提取李斯特菌落，然后采用乙醇、甲酸和乙腈對(duì)其進(jìn)行處理以獲得細(xì)胞提取物，最后通過MALDI-TOF監(jiān)測(cè)4000~12000 u范圍內(nèi)的核糖體蛋白特征峰。通過觀察某些特征峰是否存在，即可在譜系水平分離出單增李斯特菌，該結(jié)果得到脈沖凝膠電泳技術(shù)的證實(shí)。最近，Jadhav等[21]使用MALDI-TOF對(duì)不同來源的澳大利亞乳制品中的單增李斯特菌進(jìn)行鑒定和來源追蹤。然而，與其他用于菌株基因分型的方法相比，MALDI-TOF鑒定時(shí)更容易受培養(yǎng)基類型、樣品制備、樣品基質(zhì)等因素的干擾。

5.2 噬菌體

圖5 噬菌體P100修飾的磁性顆粒分離單增李斯特菌[83]Fig.5 Isolation and separation of L. monocytogenes using bacteriophage P100-modified magnetic particles [83]

噬菌體（bacteriophage）是一種特殊的病毒，能夠感染并殺死細(xì)菌或真菌等微生物。噬菌體受體結(jié)合蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的特異性受體發(fā)生結(jié)合，這種特性賦予了噬菌體很高的生物技術(shù)應(yīng)用價(jià)值。近年來，結(jié)合分子生物學(xué)、免疫學(xué)及其他學(xué)科建立起來的新興噬菌體檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高并可區(qū)分死菌和活菌細(xì)胞，在食源性病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域中顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)[89,90]。Kretzer等[91]利用噬菌體編碼的肽聚糖水解酶（內(nèi)溶素）的細(xì)胞壁結(jié)合域（CBD）蛋白代替抗體固定在順磁珠上作為與單增李斯特菌特異性結(jié)合的配體用以富集分離目標(biāo)菌，并將該技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合檢測(cè)人工接種和自然污染食物樣品（生菜、奶酪、鮭魚、肉、奶）中的單增李斯特菌。研究結(jié)果表明，樣品預(yù)濃縮6 h后，該方法對(duì)于所有食品基質(zhì)中單增李斯特菌的檢測(cè)限為102CFU/g，而預(yù)濃縮24 h后，除軟奶酪外，其他所有食品基質(zhì)中單增李斯特菌的檢測(cè)限均達(dá)到0.1 CFU/g，方法靈敏度明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。Walcher等[42]同樣利用噬菌體CBD蛋白包被的順磁珠分離富集人工接種原奶中的單增李斯特菌，并利用平板計(jì)數(shù)法或RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，方法檢測(cè)限范圍為102~103CFU/mL。Zhou等[92]利用三種不同大小的磁性顆粒通過化學(xué)和物理方法固定化噬菌體P100，建立了一種從復(fù)雜食物基質(zhì)中分離單增李斯特菌的噬菌體輔助磁性分離方法（如圖4所示），并通過研究噬菌體的偶聯(lián)率及捕獲單增李斯特菌特異性基因片段的效率對(duì)每種噬菌體修飾磁性顆粒復(fù)合物的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明，與化學(xué)固定化方法相比，采用物理方法固定化的噬菌體修飾磁性顆粒復(fù)合物對(duì)單增李斯特菌的選擇性和捕獲效率更強(qiáng)。

圖4 MALDI-TOF-MS微生物檢測(cè)原理[87]Fig.4 Principle of MALID-TOF-MS in microbiological detection

6 結(jié)語

近年來，由單增李斯特菌感染引起的食源性疾病逐年增多，人們對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)的關(guān)注度越來越高。目前我國對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)有多種，其中多種PCR方法已經(jīng)形成標(biāo)準(zhǔn)并頒布實(shí)施。免疫學(xué)測(cè)定方法，簡單快捷，尤其是免疫層析試紙條攜帶方便，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但免疫測(cè)定方法對(duì)抗體制備具有較高要求，易受其他雜菌干擾，靈敏度不夠高。使用DNA或RNA序列作為靶標(biāo)的分子測(cè)定方法特異性和靈敏度更高，但該方法的預(yù)處理較復(fù)雜，對(duì)操作技術(shù)有較高要求，主要用于實(shí)驗(yàn)室分析，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)?；诿庖邔W(xué)和核酸分析的生物傳感器技術(shù)由于操作簡便、檢測(cè)周期短、靈敏度高等特點(diǎn)逐漸發(fā)展起來，但是必須根據(jù)反應(yīng)信號(hào)選擇合適的敏感元件，盡量減少干擾并降低背景噪音。MALDI-TOF方法分析時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但容易受培養(yǎng)基類型、樣品制備、樣品基質(zhì)等因素的干擾。而基于噬菌體的方法則需要與分子生物學(xué)、免疫學(xué)及其他學(xué)科相結(jié)合。以上這些技術(shù)雖然目前還存在很多不足，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，會(huì)得到進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，特別是近年來不同學(xué)科之間的相互滲透日益加強(qiáng)，不同方法之間的結(jié)合使用會(huì)成為未來食源性單增李斯特菌檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。