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        基于代謝組學(xué)的黑龍江省不同產(chǎn)地大豆的代謝產(chǎn)物分析

        2021-06-30 15:47:54張麗媛代安娜于潤眾阮長青李志江張東杰
        現(xiàn)代食品科技 2021年6期
        關(guān)鍵詞:大豆途徑差異

        張麗媛,代安娜,于潤眾,阮長青,李志江,4,張東杰,3,5

        (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

        (2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)電氣與信息學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

        (3.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心,黑龍江大慶 163319)

        (4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

        (5.國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

        大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)最早源自中國,已有5000多年種植歷史,種植區(qū)主要分布在東北、華北、陜西、四川及長江中下游地區(qū)[1]。大豆含有蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、異黃酮等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。近年來,國內(nèi)外對大豆的研究主要包括豆制品、大豆油脂、大豆蛋白質(zhì)以及生理活性物質(zhì)等[5-7]。而比較不同地區(qū)同種大豆代謝產(chǎn)物的研究較少,主要是不同的品種、育成年份、生長階段,或加工處理后的代謝物,以及在真菌酸堿脅迫下的次生代謝產(chǎn)物[8-12]。大豆的代謝產(chǎn)物也受不同因素(氮、硅及磷含量等)影響[13-15],其可溶性糖含量與其育成年代也呈顯著正相關(guān)[16]。

        代謝組學(xué)是對小分子化合物(分子量1000 u以下),運(yùn)用色譜、質(zhì)譜、核磁共振和毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行研究[17,18]。它可被應(yīng)用在食品造假鑒定、食品產(chǎn)地溯源[19-21]、食品真實屬性鑒別、發(fā)酵食品有毒代謝產(chǎn)物分析及植物源性食品等方面[22,23]。楊冬爽等基于代謝組學(xué)研究野大豆(Glycine soja)的耐鹽機(jī)理[24],張圳等利用高效液相色譜法測定了體外大鼠腸道菌液中大豆苷及其代謝物[25],張玉梅等進(jìn)行了菜用大豆籽粒代謝物的相關(guān)性分析[26]。而非靶向代謝組學(xué)則是在有限的相關(guān)研究和背景知識的基礎(chǔ)上整個代謝組進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析獲取大量代謝物的數(shù)據(jù),并對其進(jìn)行處理從而找出差異代謝物的一種研究方法[27]。近年來許多學(xué)者利用非靶向代謝組學(xué)研究人參治療脾氣虛癥、漢麻籽生理活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)基因奶牛的血清和牛奶的代謝產(chǎn)物等[28-30]。

        本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)非靶向代謝譜技術(shù)分析了寒地三個不同產(chǎn)區(qū)同一品種的大豆代謝產(chǎn)物和代謝途徑,分離和鑒定了差異代謝產(chǎn)物,并對其代謝機(jī)制進(jìn)行了探索。這可為寒地大豆品質(zhì)分析提供理論基礎(chǔ),也為大豆進(jìn)行分類加工或分產(chǎn)地提取功能性成分提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        研究的黑河43號品種大豆來自黑龍江省北安龍門(BALM-soy)、尾山(WS-soy)和引龍河(YLH-soy)三個產(chǎn)地。按照保護(hù)范圍內(nèi)具有代表性的抽樣原則,采用棋盤抽樣法隨機(jī)抽取來自三個產(chǎn)地的大豆樣品。

        甲醇、異丙醇和乙腈(色譜級),美國Fisher技術(shù)公司;N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA),甲氧胺鹽酸鹽和吡啶,美國Sigma-Aldrich公司;結(jié)構(gòu)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),美國Sigma-Aldrich公司,北京國家藥品和生物制品控制研究所;色譜級用水,美國米利波爾公司的Milli-q水凈化系統(tǒng);其他分析級試劑均來自北京化工廠。

        1.2 儀器與設(shè)備

        GC-MS-QP 2010(配備EI離子源),四極質(zhì)量分析儀及AOC-20 i自動采樣器,日本島津技術(shù)有限公司;HP-5 ms分離柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent有限公司;KQ2200E型超聲波清洗機(jī)(40 kHz,100 W),昆山超聲儀器有限公司;昆山恒溫均衡器,昆山恒溫均衡器有限公司;MSC-100恒溫均衡器,杭州澳盛儀器有限公司;Alpha1-2Ldplus冷凍干燥機(jī),德國CHRIST公司;TGL-16B高速離心機(jī),安亭儀器有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 大豆代謝物的提取與衍生化

        大豆在液氮作用下粉碎,經(jīng)100目篩網(wǎng)篩分,保存于-80 ℃,將100.0 mg大豆樣品,800 μL 80%甲醇水溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)(2-氯苯丙氨酸)置于EP管中。均質(zhì)化前充分?jǐn)嚢?0 s。從大豆樣品中提取極性代謝物組分。為提高提取效率,將含有該混合物的EP管在35 ℃ 80 W超聲9.0 min,并劇烈搖動1 min,4 ℃,12,000 r/min離心10.0 min。取200 μL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL自動樣品瓶,冷凍干燥器中干燥過夜。殘余物37 ℃在30 μL(20 mg/mL)甲氧基胺鹽酸鹽和吡啶中溶解60 min,加入30 μL BSTFA,70 ℃ 60 min衍生化處理后,24 h內(nèi)分析所得溶液。

        1.3.2 GC-MS分析

        自動取樣器注入1 μL樣品液,色譜柱:Agilent J&W Scientific HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:80 ℃,保持2 min,10 ℃/min的速度升至320 ℃,保持6 min;80 ℃下進(jìn)行溫度平衡6 min,然后再注入下一次樣品。儀器參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)樣口溫度280 ℃,EI離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,高純氦氣(純度大于99.999%)作為載氣,進(jìn)樣量1.0 μL,不分流進(jìn)樣。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測,質(zhì)譜檢測范圍:50~550m/z。

        1.3.3 代謝物定性分析與定量分析

        定性分析:將獲得的大豆代謝物數(shù)據(jù)與NIST 14數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以獲得結(jié)構(gòu)信息并分類,并研究大豆樣品的差異代謝產(chǎn)物。

        定量分析:采用峰面積歸一化法進(jìn)行各大豆樣品成分相對含量的計算,每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

        1.3.4 代謝機(jī)制分析

        通過KEGG數(shù)據(jù)庫比較代謝物的代謝途徑。利用KEGG代謝途徑檢索中的富集分析來分析不同品種大豆的代謝機(jī)制。在KEGG篩選的差異代謝物中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的代謝途徑,推斷不同產(chǎn)地的大豆樣品代謝過程的變化。

        1.3.5 數(shù)據(jù)處理

        采用Excel軟件對GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 GC-MS結(jié)果分析

        注:“-”表示未檢測到代謝產(chǎn)物。

        三個產(chǎn)地大豆的GC-MS總離子流圖如圖1、2和3所示。

        圖1 北安龍門大豆總離子流圖Fig.1 Totalion flow diagram of BALM-soy samples

        從三個總離子流圖可以看出產(chǎn)地不同,品種相同的大豆樣品的代謝產(chǎn)物明顯存在不同。三個產(chǎn)地的大豆樣品中共檢測到68種代謝產(chǎn)物(表1)。其中62種化合物經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫精確表征,包括22種糖類及其衍生物,14種脂肪酸及其衍生物,7種醇類,4種酯類,2種氨基酸和13種中間體,6種化合物推斷出可能結(jié)構(gòu)。BALM-soy樣品中檢測到34種代謝物,其中Area>1%的代謝物占總量的65.18%。WS-soy樣品中檢測到20種代謝物和4種未知化合物,其中Area>1%的代謝物占總量的40.21%。YLH-soy樣品中檢測到23種代謝物和2種未知化合物,其中Area>1%的代謝物占總量的36.55%。

        表1 三個產(chǎn)地大豆樣品中的代謝產(chǎn)物Table 1 Metabolites form soybean samples from three producing areas

        圖2 尾山大豆總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of WS-soy samples

        圖3 引龍河大豆總離子流圖Fig.3 Total ion flow diagram of YLH-soy samples

        2.2 BALM-soy樣品的差異代謝分析

        相比較其他兩個產(chǎn)區(qū)大豆樣品,BALM-soy樣品有21種差異代謝物(6種糖類,5種脂肪酸,4種醇類,2種酯類,1種氨基酸和3種中間體)(表2)。差異代謝物主要涉及氨基酸代謝(半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑)、糖類代謝(半乳糖代謝途徑、蔗糖和淀粉代謝、甲基半乳糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[31]、赤蘚糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、果糖和甘露糖代謝)、脂質(zhì)代謝(甘油脂質(zhì)代謝、亞油酸代謝、脂肪酸生物合成和不飽和脂肪酸生物合成)及其他代謝途徑(甾體生物合成)。糖酵解,脂肪酸的氧化合成和TCA循環(huán)之間存在一定的關(guān)系,而碳水化合物代謝,脂代謝會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物參與上述過程,此地大豆樣品產(chǎn)生的差異代謝物如D-阿洛酮糖(0.41%),D-塔羅糖(2.91%),蔗糖(0.61%)及甘油(0.63%)與其有關(guān),北安龍門產(chǎn)區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候,降水較多且集中在夏季,適宜大豆的生長,夏季光照時間長,有利于進(jìn)行光合作用,積累蔗糖,半乳糖(0.56%)等糖類,并通過半乳糖代謝途徑等過程進(jìn)行轉(zhuǎn)化。該產(chǎn)地土壤為黑土,土壤中含有腐殖質(zhì)層,肥力水平高,為作物提供養(yǎng)分,雨水與土體內(nèi)鹽基相遇,碳酸鹽移出土體,土壤呈中性至微酸性,pH在6.0~8.5之間,有利于D-阿洛酮糖和D-塔羅糖的產(chǎn)生。飽和脂肪酸的碳鏈延長在線粒體進(jìn)行,不飽和脂肪酸在微粒體中進(jìn)行去飽和作用,充足的日照有利于植物進(jìn)行氧化代謝,生成飽和脂肪酸包括甘油和十五烷酸(0.22%),以及不飽和脂肪酸包括8,11-十八碳二烯酸(0.45%),9,12-十八碳二烯酸(1.83%),9-十八碳二烯酸(0.74%)。

        表2 BALM-soy樣品的差異代謝物Table 2 Differential metabolites of BALM-soy samples

        2.3 WS-soy樣品的差異代謝分析

        WS-soy樣品有16種差異代謝物(5種脂肪酸,2種醇類,2種酯類,1種氨基酸和6種中間體)(表3)。差異代謝物主要涉及氨基酸代謝(精氨酸和脯氨酸代謝途徑)、脂質(zhì)代謝(苯丙氨酸代謝、脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成)及其他代謝途徑(氮代謝途徑和氰基氨基酸代謝途徑[32])。尾山產(chǎn)地屬寒溫帶大陸季風(fēng)氣候,夏季短促,氣溫較溫帶季風(fēng)氣候低,使其脂肪酸類產(chǎn)物不同,碳水化合物較少。其大豆樣品的差異代謝物主要是一些酸類,酯類,可能是該大豆在脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、花生四烯酸代謝過程中產(chǎn)生了6-十六碳烯酸(1.33%)、辛酸(0.46%)、花生酸(0.79%)和鄰苯二甲酸(3.83%)。該產(chǎn)地土壤為黑鈣土,其肥力不及黑土,但也有腐殖質(zhì)層,含有豐富的氮素以及磷和鉀,降水也比北安龍門少,有利于脯氨酸(5.47%)的積累,此外滲入土體的重力水流只能對鉀、鈉等一價鹽離子進(jìn)行充分淋溶,而鈣、鎂等二價鹽離子只能部分淋溶,產(chǎn)生了不同的差異代謝物。

        表3 WS-soy樣品的差異代謝物Table 3 Differential metabolites of WS-soy samples

        2.4 YLH-soy樣品的差異代謝分析

        YLH-soy樣品有9種差異代謝產(chǎn)物(7種糖類和2種中間體)(見表4所示)。差異代謝物主要涉及糖類代謝(半乳糖代謝途徑、戊糖磷酸代謝途徑)及其他代謝途徑(嘧啶代謝途徑)。該樣品產(chǎn)地與BALM-soy產(chǎn)地同屬中溫帶大陸季風(fēng)氣候,其差異代謝物主要是糖類,而且與BALM-soy代謝產(chǎn)物中一些糖類不同,可能是因為碳水化合物代謝過程中如半乳糖代謝途徑產(chǎn)生塔格糖(0.60%),戊糖磷酸途徑產(chǎn)生核糖(14.62%),以及嘧啶代謝途徑產(chǎn)生尿苷(0.24%)等。糖類的產(chǎn)生是由于播種時期不同,氣溫的影響導(dǎo)致光合作用程度不同。

        表4 YLH-soy樣品的差異代謝物Table 4 Differential metabolites of YLH-soy samples

        2.5 未知化合物結(jié)構(gòu)分析

        根據(jù)質(zhì)譜圖中碎片離子峰的質(zhì)荷比,推測6種未知結(jié)構(gòu)代謝產(chǎn)物(見表5所示),其中C9H18O為(2S,3S)-2-丁基-3-丙基環(huán)氧乙烷,C23H24N4為1,8-二(4-硝基苯甲基)-3,6-二氮雜胺-9-酮,推測C6H9N3S為2-甲基-2,6-二氫-4H-噻吩并[3,4-c]吡唑-3-胺,推測C27H20O12為α-玉紅霉素,推測為C13H32O4Si2為3,6,10,13-四氧合-2,14-二硅戊烷,2,2,14,14-四甲基硅烷;推測 C17H40O5Si2為3,7,11,15,18-五氧雜-2,19-二硅二十烷,2,2,19,19-四甲基硅烷。

        表5 未知化合物結(jié)構(gòu)列表Table 5 Unknown compound structure list

        3 結(jié)論

        對大豆中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定,共檢測到68種代謝產(chǎn)物,其中62種精確鑒定,包括22種糖類及其衍生物,14種脂肪酸及其衍生物,7種醇類,4種酯類,2種氨基酸和13種中間體,并推斷出6種未知代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu),WS-soy樣品4種,YLH-soy樣品2種。通過對大豆樣品的比較發(fā)現(xiàn)BALM-soy樣品存在21種差異代謝產(chǎn)物,包括6種糖類,5種脂肪酸,4種醇類,2種酯類,1種氨基酸和3種中間體。WS-soy樣品有16種差異代謝產(chǎn)物,包括5種脂肪酸,2種醇類,2種酯類,1種氨基酸和6種中間體。YLH-soy樣品有9種差異代謝產(chǎn)物,包括7種糖類和2種中間體。通過KEGG數(shù)據(jù)庫確定代謝產(chǎn)物的代謝途徑,包括氨基酸代謝,碳水化合物代謝,脂質(zhì)代謝等,BALM-soy樣品不同代謝途徑包括半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑、蔗糖和淀粉代謝途徑、甲基半乳糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、果糖和甘露糖代謝途徑、赤蘚糖醇運(yùn)輸系統(tǒng),甘油代謝,亞油酸代謝和甾體生物合成。WS-soy樣品的不同代謝途徑為精氨酸和脯氨酸代謝途徑,苯丙氨酸代謝途徑、氰基氨基酸代謝途徑和氮代謝途徑。YLH-soy樣品的不同代謝途徑是戊糖磷酸代謝途徑和嘧啶代謝途徑。BALM-soy和YLH-soy兩產(chǎn)地屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候,有利于糖的積累,WS-soy產(chǎn)地屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候,有利于脂肪酸的積累。大豆樣品產(chǎn)地的溫度、降水、土壤等會導(dǎo)致代謝途徑和代謝機(jī)制的差異。

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