魏建敏，陳燕，陳莉，盧紅梅

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025）

紅茶屬于全發(fā)酵茶，通過典型的萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工藝流程精制而成，因沖泡后的茶湯和葉底色呈紅色而得名，是目前世界上生產(chǎn)和貿(mào)易量最大的茶類[1-3]。大量的研究證明了紅茶具有預防癌癥、防治高血糖、預防肥胖等作用[4-8]。石榴為石榴科植物，以維生素C含量高而著稱，在作為水果食用的同時還具有很大的藥用價值[9]。其含有豐富的多酚類、生物堿、維生素、有機酸等生物活性成分[10]，有抗炎、抗腫瘤、降低膽固醇等作用[11-13]。因其鮮果中總糖含量占14%~18%[14]，宜作為果醋發(fā)酵原料。

茶果醋是以茶葉為主要原料，將茶原汁與果汁混合，經(jīng)發(fā)酵調(diào)配而成的醋的統(tǒng)稱，不僅保留了茶和水果的營養(yǎng)價值，還具備醋的風味特征，具有一定的保健功效[15]。目前關于茶果醋的研究并不多，且多以綠茶、黑茶為主要原料進行發(fā)酵，柏旭等[16]以酸木瓜為主要原料，添加普洱茶湯及新鮮咖啡汁發(fā)酵木瓜復合風味茶果醋；張芳等[17]對以茶葉和蘋果汁為原料發(fā)酵茶果醋的工藝條件進行研究，最終釀造的茶果醋同時具有蘋果和茶葉的特殊清香味，口感醇厚；張學良等[18]以綠茶、桑葚為原料研制出色澤透明、具有清淡的綠茶和醋香氣味的綠茶桑椹醋飲料。

隨著生活水平的提高，人們在食品的選擇上愈發(fā)向綠色健康的產(chǎn)品傾斜。茶果醋的開發(fā)對提高茶葉的綜合利用、茶葉的附加值有重要意義。本研究以紅茶和石榴為主要原料，以酵母菌、醋酸菌作為發(fā)酵菌種，從紅茶果醋發(fā)酵的酒精階段和醋酸階段對其生產(chǎn)工藝進行研究，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，以期兩種發(fā)酵原料能在風味、營養(yǎng)成分等方面達到互補增強的效果，并為茶果醋的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶碎茶，產(chǎn)自貴州省遵義市湄潭縣；石榴，產(chǎn)自云南省紅河哈尼族彝族自治州蒙自市；安琪酵母、安琪發(fā)酵營養(yǎng)劑FN502，安琪酵母股份有限公司；分析純蔗糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；醋酸菌種，為實驗室保藏巴氏醋酸桿菌。

1.2 儀器與設備

G80F23CN1P-G5(S0)微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱，上?，槴\實驗設備有限公司；DZ-1磁力攪拌器、ZD-2A酸度計，上海大普儀器有限公司；ATC手持糖度計，上海天壘儀器儀表有限公司；立式高壓蒸氣滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；722S可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；ZD-85A恒溫震蕩培養(yǎng)箱，常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅茶果醋制作工藝流程

1.3.2 菌種活化

酵母菌菌種活化：取一定量的安琪酵母（以茶湯和果汁混合后的體積百分比計），加入10倍濃度為2%蔗糖水，放入35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min后待用。

醋酸菌種活化：采用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。稱取葡萄糖1 g，酵母膏1 g，瓊脂2 g，碳酸鈣2 g，加100 mL蒸餾水溶解，高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，冷卻至70 ℃后加入3.5 mL無水乙醇，并及時倒入培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后，接入醋酸桿菌，倒置，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.3.3 酒精發(fā)酵工藝的確定

1.3.3.1 單因素實驗

以發(fā)酵液中茶多酚含量和酒精度為評價指標，選取浸提方式、浸提時間、茶水比、茶果汁比、接種量、加糖量為試驗因素。分別設計浸提方式為微波加熱浸提5 min，90 ℃恒溫水浴鍋中浸提15 min；浸提時間為2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min；茶水比為1:100、3:100、5:100、7:100、9:100；茶果汁比為1:1、1:3、1:5、1:7、1:9；接種量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；加糖量為12 g/100 mL、14 g/100 mL、16 g/100 mL、18 g/100 mL、20 g/100 mL。當考察其中一個因素時，其余因素分別為：浸提方式和時間為微波中加熱5 min浸提、茶水比為5:100、茶果汁比為1:5、接種量為0.3%、加糖量為16 g/100 mL、28 ℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天測定酒精度和茶多酚，直至酒精度不再變化。

1.3.3.2 正交試驗

在酒精發(fā)酵單因素實驗的基礎上，選擇茶果汁比（A）、酵母菌接種量（B）、加糖量（C）為研究因素，選取3個水平，進行3因素3水平的正交實驗，以酒精含量為主要研究指標，確定最優(yōu)的酒精發(fā)酵條件參數(shù)。各因素水平見表1。根據(jù)正交試驗結(jié)果，對所得工藝條件進行3次平行驗證，并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標進行檢測，以得到品質(zhì)較好的紅茶果酒。

表1 酒精發(fā)酵正交實驗因素水平表Table 1 Table of orthogonal experimental factors of alcohol fermentation

1.3.3.3 酒精發(fā)酵工藝驗證

根據(jù)正交試驗結(jié)果，對所得工藝條件進行3次平行驗證，并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標進行檢測，以期得到品質(zhì)較好的紅茶果酒。

1.3.4 醋酸發(fā)酵工藝的確定

1.3.4.1 單因素實驗

以發(fā)酵液中酸度和殘留酒精度為評價指標，選取初始酒精度、發(fā)酵溫度、裝瓶量、接種量為試驗因素。分別設計初始酒精度為6% vol、7% vol、8% vol、9%vol、10% vol；發(fā)酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃；裝瓶量為20%、30%、40%、50%、60%；接種量為3%、6%、9%、12%、15%。當考察其中一個因素時，其余因素分別為：初始酒精度為7% vol的茶果酒、發(fā)酵溫度為32 ℃、裝瓶量為40%、接種量為9%、按1 g/100 mL比例加入營養(yǎng)鹽。每天測定酸度和茶多酚，直至酸度不再變化。

1.3.4.2 正交試驗

在醋酸發(fā)酵單因素實驗的基礎上，選取初始酒精度（A）、醋酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）三個因素為研究因素，選取3個水平，進行3因素3水平的正交實驗，以酸度為主要研究指標，確定最優(yōu)的醋酸發(fā)酵條件參數(shù)。各因素水平見表2。根據(jù)正交實驗結(jié)果，對所得工藝條件進行3次平行驗證，并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標進行檢測，以得到品質(zhì)較好的紅茶果醋。

表2 醋酸發(fā)酵正交實驗因素水平表Table 2 Table of orthogonal experimental factors of acetic acid fermentation

1.3.4.3 醋酸發(fā)酵工藝驗證

根據(jù)正交實驗結(jié)果，對所得工藝條件進行3次平行驗證，并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標進行檢測，以期得到品質(zhì)較好的紅茶果醋。

1.3.5 理化指標及微生物指標的測定

酒精度：參照 AOAC Official Method 969.12:Alcohol in Wines by Dichromate Oxidation，重鉻酸鉀氧化法；總酸：參照GB/T 5009.41-2003[19]，酸堿滴定法；茶多酚：參照GB/T 21733-2008[20]，分光光度法；還原糖：DNS法；可溶性固形物（SSC）：采用手持糖度計測定；氨基酸態(tài)氮：參照GB/T 5009.235-2016[21]進行測定；氨基酸含量：將最優(yōu)工藝發(fā)酵所得茶果醋澄清處理后，采用氨基酸全自動分析儀測定；pH：酸度計測定；菌落總數(shù)：參照GB 4789.2-2016[22]進行測定；大腸菌群：參照GB 4789.3-2016[23]進行測定；致病菌：參照GB 29921-2013進行測定[24]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復試驗結(jié)果的平均值±標準差。使用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理；采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，p<0.05認為顯著性差異；通過Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵單因素實驗

2.1.1 浸提方式對酒精發(fā)酵的影響

由圖1可知，浸提方式對酒精度的影響不大，但對茶多酚的保留影響較大。兩種浸提方式間酒精度含量相差0.5% vol；而微波浸提發(fā)酵結(jié)束后茶多酚含量達1228.384 mg/L，相比90 ℃熱水浸提時，有顯著增加。綜合后期紅茶果醋產(chǎn)品的風味和營養(yǎng)價值考慮，選擇微波浸提方式更適宜。

圖1 浸提方式對酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of extraction method on alcoholic fermentation

2.1.2 浸提時間對酒精發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著浸提時間的增加，茶多酚含量和酒精度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。茶多酚和酒精度在4 min時達到最大值，4 min后開始緩慢下降，這是因為隨著浸提時間的增加，部分茶多酚發(fā)生緩慢氧化或分解，導致茶多酚含量的降低[25]；此外，茶湯長時間處于高溫下，導致茶湯中的大部分營養(yǎng)物質(zhì)丟失，不利于酵母菌進行酒精發(fā)酵，因此浸提4 min較合適。

圖2 浸提時間對酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of extraction time on alcoholic fermentation

2.1.3 茶水比對酒精發(fā)酵的影響

茶多酚的含量與茶水比密切相關。由圖3可知，隨著茶水比例的增大，茶多酚含量顯著增加。當茶水比為1:100和3:100時，發(fā)酵后的酒精度較低，這可能與該比例下茶湯濃度低，酵母菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)少有關；當茶水比大于5:100時，茶多酚含量較高，高濃度的茶多酚可能抑制了酵母菌的生長，導致酒精度明顯降低。因此選擇5:100的茶水比進行酒精發(fā)酵較為適宜。

圖3 茶水比對酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of tea water ratio on alcohol fermentation

2.1.4 茶果汁比對酒精發(fā)酵的影響

如圖4所示，隨著茶湯與果汁混合液中果汁比例的不斷加大，茶多酚含量在減少，酒精度會上升直至趨于穩(wěn)定。果汁的多少影響著后面蔗糖的加入量，加入的果汁少，需要補加的蔗糖多，所得紅茶果酒風味欠缺，茶味重；加入的果汁多，紅茶果酒的茶味淡，同樣風味欠缺，因此要想得到風味較好的紅茶果酒，應選擇1:3~1:7的茶果汁比進行酒精發(fā)酵。

圖4 茶果汁比對酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of tea juice ratio on alcoholic fermentation

2.1.5 接種量對酒精發(fā)酵的影響

如圖5所示，茶多酚和酒精度在接種量為0.3%時均達到最大值，此后隨著接種量的增加呈大幅度下降趨勢。接種量是影響發(fā)酵過程的一個主要因素，接種量太小，菌種延遲期會增加，營養(yǎng)物質(zhì)不能充分轉(zhuǎn)化，發(fā)酵產(chǎn)物積累少；接種量太大，則會加快發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期，不利于風味物質(zhì)形成和品質(zhì)穩(wěn)定[26]，同時還會產(chǎn)生脂類、醛類等刺激性氣味，影響口感[27]。因此選取0.2%~0.4%的接種量為宜。

圖5 接種量對酒精發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of inoculation amount on alcoholic fermentation

2.1.6 加糖量對酒精發(fā)酵的影響

加糖量的多少決定了酒精度的多少[15]。由圖6可知，茶多酚和酒精度都隨著糖量的增加而增長。加糖量為12 g/100 mL時，所得酒精度低于6% vol，達不到后期進行醋酸發(fā)酵的要求；加糖量為20 g/100 mL時，酒精度接近10% vol，此時發(fā)酵液中容易出現(xiàn)滲透壓高，溶氧量少的情況，從而影響酵母菌對糖的利用，且當初始酒精量高于10%時，會抑制醋酸菌生長，不利于醋酸發(fā)酵[15,28]。因此糖添加量最佳選取范圍為14 g/100 mL~18 g/100 mL。

圖6 加糖量對酒精發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of sugar content on alcohol fermentation

2.2 酒精發(fā)酵正交實驗

由表3可知，RC>RB>RC，即加糖量（R=0.97）對酒精發(fā)酵的影響最大，其次是接種量（R=0.88），影響最小的是茶果汁比（R=0.32），最優(yōu)組合是A2B1C2，即茶果汁比1:5，接種量0.2%，加糖量16 g/100 mL。

表3 酒精正交實驗結(jié)果Table 3 Alcohol orthogonal experiment results

為了進一步驗證所得正交實驗結(jié)果，進行了方差分析。從表4中可以看出，加糖量C達顯著水平，接種量B和茶果汁比A不顯著，但還是有一定影響，與極差分析所得結(jié)果一致。因此，加糖量是影響紅茶果醋酒精發(fā)酵的主要因素，在發(fā)酵過程中要著重控制；接種量和茶果汁以及其他因素也要根據(jù)實際情況確定其添加量。

表4 酒精發(fā)酵正交實驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results of alcohol fermentation

2.3 酒精發(fā)酵工藝驗證

在進行3次平行驗證后發(fā)現(xiàn)，在此工藝條件下，所得紅茶果酒質(zhì)量指標較好。

2.3.1 感官指標

外觀：透明發(fā)亮，有原茶湯色和石榴汁色；香味：酒味醇厚，有茶香和果香；口感：口感豐裕，口味協(xié)和，茶味適中；風格：典型完備，風格獨特。

2.3.2 理化指標

各理化指標如表5所示。

表5 酒精發(fā)酵工藝驗證實驗理化指標Table 5 The physicochemical indexes of the experiment were verified by alcohol fermentation process

2.4 醋酸發(fā)酵單因素實驗

2.4.1 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響

初始酒精度直接決定了產(chǎn)酸量的多少。酒精度過低，不能滿足醋酸菌的生長需要，導致酸度偏低，達不到標準；酒精度過高，耐酒精能力差的醋酸菌則會受到抑制，不利于發(fā)酵的進行。由圖7可知，隨著酒精度的升高，酸度呈先上升后下降的趨勢，這說明高酒精度對于醋酸菌的發(fā)酵是有影響的。對于茶多酚而言，茶多酚的保留程度與酸度成反比。酸度越高，茶多酚保留程度越低；酸度越低，茶多酚保留程度越高。因此，要想得到酸度較高，茶多酚保留程度也較高的紅茶果醋，應選擇6% vol~8% vol的初始酒精度。

圖7 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of initial ethanol content on acetic acid fermentation

2.4.2 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

對于醋酸發(fā)酵過程來說，溫度是一個重要的發(fā)酵條件。溫度過低，菌種活化不充分，活力低，產(chǎn)酸率低；溫度過高，發(fā)酵快，菌種提前老化，產(chǎn)酸也不理想。因此，應選擇適宜的溫度進行紅茶果醋的發(fā)酵。由圖8可知，隨著溫度的升高，酸度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而茶多酚則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當溫度為32 ℃時，酸度達到最大值，此時茶多酚的保留程度有361.253 mg/L。因此，在30 ℃~34 ℃范圍內(nèi)進行醋酸發(fā)酵較為合適。

圖8 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.8 Effects of fermentation temperature on acetic acid fermentation

2.4.3 裝瓶量對醋酸發(fā)酵的影響

醋酸發(fā)酵過程為有氧發(fā)酵，裝瓶量的多少直接決定發(fā)酵過程中的氧氣供應量。裝瓶量過高，供氧量不足，醋酸菌的生長受到抑制，紅茶果醋酸度低，酒味濃；裝瓶量過低，紅茶果醋pH值低，口感刺激，發(fā)酵快，不利于風味物質(zhì)的形成。由圖9可知，當裝瓶量為20%~40%時，酸度穩(wěn)定在5.5 g/100 mL左右；當裝瓶量超過40%時，酸度急劇下降，到60%時，酸度只有3.48 g/100 mL。綜合考慮，選擇裝瓶量20%~40%進行醋酸發(fā)酵。

圖9 裝瓶量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.9 Effects of bottling quantity on acetic acid fermentation

2.4.4 接種量對醋酸發(fā)酵的影響

接種量與發(fā)酵效果密切相關。接種量過少，發(fā)酵緩慢，醋酸菌不能完全將乙醇氧化為醋酸[29]；接種量過多，發(fā)酵快，品質(zhì)差，加大了原料的投入。如圖10所示，在醋酸菌接種量為3%~9%范圍內(nèi)時，酸度呈上升趨勢；在9%~15%范圍內(nèi)時，酸度呈下降趨勢。在接種量9%和12%時，酸度變化不大，且在9%時酸度達到最大值5.94 g/100 mL。綜合考慮，選擇接種量6%~12%進行醋酸發(fā)酵。

圖10 接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.10 Effects of inoculation amount on acetic acid fermentation

2.5 醋酸發(fā)酵正交實驗

表7 醋酸發(fā)酵正交實驗結(jié)果方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal experimental results of acid fermentation

由表6可知，RC>RA>RB，即發(fā)酵溫度（R=1.08）對醋酸發(fā)酵的影響最大，其次是初始酒精度（R=0.58），影響最小的是接種量（R=0.22），最優(yōu)組合是A2B3C1，即初始酒精度7% vol，醋酸菌接種量12%，發(fā)酵溫度30 ℃。

表6 醋酸發(fā)酵正交實驗結(jié)果Table 6 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation

為了進一步驗證所得正交實驗結(jié)果，進行了方差分析。從表中可以看出發(fā)酵溫度C達顯著水平，初始酒精度A和醋酸菌接種量B不顯著，但還是有一定影響，與極差分析所得結(jié)果一致。因此，在紅茶果醋醋酸發(fā)酵過程中，對發(fā)酵溫度要嚴格控制；初始酒精度和醋酸菌接種量以及其他因素也要根據(jù)實際情況加以控制。

2.6 醋酸發(fā)酵工藝驗證

在正交試驗結(jié)果得出的工藝條件下，進行3次平行驗證后發(fā)現(xiàn)，所得紅茶果醋產(chǎn)品質(zhì)量指標較好。

2.6.1 感官指標

色澤：呈琥珀色；滋味：口感佳，酸甜比例適中，無異味，無澀味；香氣：具有茶香、醋香和果香，香氣協(xié)和，無刺激性氣味；體態(tài)：澄清，透明，沉淀少。

2.6.2 理化指標

各理化指標如表8所示。

表8 醋酸發(fā)酵工藝驗證實驗理化指標Table 8 The physical and chemical indexes of the experiment were verified by acetic acid fermentation

2.6.3 微生物指標

菌落總數(shù)：11 cfu/mL，大腸菌群：未檢出，致病菌：未檢出。微生物指標均符合“GB/T 2719-2018食品安全國家標準食醋”[30]的要求。

2.6.4 氨基酸含量

通過氨基酸全自動分析儀法，對紅茶果醋中的各種氨基酸含量進行檢測，所得氨基酸種類和含量如表9所示。

氨基酸對維系人體生命活動具有重要意義，它不僅具有各種生理功能，而且能緩沖醋中的酸味，使紅茶果醋口感更加柔和、鮮美、醇厚[31]。由表9可知，紅茶果醋中含有16種氨基酸，氨基酸總量為5.93 mg/mL，明顯高于張露[32]等人的研究。其中谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的含量較高，分別為1.12 mg/mL、0.60 mg/mL、0.43 mg/mL；含有必須氨基酸6種，共2.28 mg/mL，占所含氨基酸總數(shù)的38.45%，其中賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸的含量較高，分別為0.50 mg/mL、0.42 mg/mL、0.40 mg/mL，這些氨基酸的存在，豐富了紅茶果醋營養(yǎng)成分和口感風味。

表9 茶果醋中各種氨基酸含量測定結(jié)果Table 9 Results of determination of various amino acids in tea fruit vinegar

3 結(jié)論

本實驗以紅茶和石榴為原料，對紅茶果醋的發(fā)酵工藝進行研究和優(yōu)化。通過單因素實驗和正交試驗得到紅茶果醋最佳生產(chǎn)工藝條件為：微波浸提4 min，茶水比5:100，茶果汁比1:5，酵母菌接種量0.2%，加糖量16 g/100 mL，于28 ℃下酒精發(fā)酵；醋酸發(fā)酵條件為裝液量30%，初始乙醇含量7% vol，發(fā)酵溫度30 ℃，醋酸菌接種量12%。所得到的紅茶果醋富含16種氨基酸，總含量為5.93 mg/mL，其中必須氨基酸為6種，占總含量的38.45%；顏色呈琥珀色，兼具茶香、醋香和果香，具有獨特風味。優(yōu)化發(fā)酵工藝后的紅茶果醋對后續(xù)的研究和工業(yè)化生產(chǎn)具有一定參考價值。