楊肖杰,黃卉,李來好,楊賢慶,趙永強,岑劍偉,郝淑賢*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州,510300)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)富含蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)元素、維生素和多種對人體有益的氨基酸，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，深受廣大消費者喜愛[1-2]。去殼蝦仁是蝦加工的主要產(chǎn)品，但外殼通過表皮內(nèi)纖維緊密地附著在表皮上，同時表皮內(nèi)纖維通過微管相互交叉牢固地連接在肌肉上[3]，使得鮮蝦殼難以剝離。因此，剝殼前需進行預處理使殼肉間的緊密連接松動。常用的殼肉松動方法是速凍后進行解凍再剝殼或采用超高壓技術(shù)，但都易造成蝦仁品質(zhì)劣變，限制了其產(chǎn)業(yè)化應用[4]。

近年來，常用酶解蝦殼或蝦頭來回收蛋白質(zhì)，或得到富含多肽的酶解產(chǎn)物[5-7]。羅春燕等[8]通過響應面法優(yōu)化了魷魚須胰酶脫皮的工藝參數(shù)，得到的樣品白度值較好，原料保留率高，且質(zhì)構(gòu)特性與肌纖維組織均無顯著變化；DANG等[10]報道了Endocut-03L和Exocut-A0復合蛋白酶促進凍蝦(Pandalusborealis)剝殼的效果，蝦殼和表皮的大分子蛋白質(zhì)降解破壞殼肉連接，是酶法便捷剝殼的主要原因[11]。但關(guān)于酶法預處理促進鮮蝦便捷剝殼的研究及其對蝦肉品質(zhì)的影響則鮮有報道。本研究以鮮活南美白對蝦為原料，基于質(zhì)構(gòu)儀以剝殼單位功為響應值，優(yōu)化酶促剝殼的工藝參數(shù)；并探討酶法前處理對蝦仁品質(zhì)的影響，為機械剝殼的產(chǎn)業(yè)應用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦,于2019年8～10月購于廣州超市,蝦體規(guī)格長11～13 cm,20 min內(nèi)運往實驗室。固定液：4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.3)、中性蛋白酶(≥200 U/mg)、堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、風味蛋白酶(≥15 U/mg)和動物蛋白水解酶(≥90 U/mg),博美生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶活性測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；NaCl為食品級,其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

QTS-25質(zhì)構(gòu)儀,英國CNS FARNEL有限公司；IKA-T25組織勻漿機,德國IKA公司；CR-400色差計,日本KONICA MINOLTA公司；3K30臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司；Sunrise-basic吸光酶標儀,德國 TECAN 公司；BX53顯微鏡,日本OLYMPUS。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

鮮蝦洗凈,加冰猝死,去除蝦頭、蝦足,放入自封袋備用[9]。酶處理過程如下:以20 g/L的標準鹽水溶液配制不同質(zhì)量濃度的酶溶液,取酶液倒入燒杯中,放入12只蝦(3節(jié)蝦身),約(50±5)g,完全浸沒。為保證酶液的均勻分布和蝦肉品質(zhì),以280 r/min的速度攪拌,酶液的溫度為(5±2) ℃,直至剝殼。取出樣品,濾去多余的水分,稱重并記錄質(zhì)量(m)。一批置于-20 ℃冰箱中冷凍24 h,流水解凍后剝殼。以冷凍24 h后脫殼的蝦仁和新鮮蝦仁為對照,對酶促剝殼的蝦肉品質(zhì)進行評價。

1.3.2 剝殼效果測定

參考YANG等[11]的方法,如圖1所示用質(zhì)構(gòu)儀分析蝦體剝殼效果。將頂部探針穿過蝦體背部殼肉之間(圖1-b),底部基座上的針插入蝦身肌肉中間(圖1-c),進行張力測試,同時將殼從蝦體剝離(圖1-d),測定條件：測試速度 2.5 mm/s;目標距離 60 mm;觸發(fā)力5.0 g。剝殼后,分為完全剝殼的蝦(蝦殼完全剝掉)和未完全剝殼的蝦(蝦殼沒有剝掉或有部分破碎蝦殼粘連在肉上),只有完全剝殼的蝦用于計算蝦的剝殼用功,記為剝殼單位功(mJ/g,下同)。

圖1 剝殼方法及過程Fig.1 The method and procession of shrimp peeling

1.3.3 蛋白酶的篩選

選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶和動物蛋白水解酶,為保證酶液的作用活性一致,酶添加量分別為0.500、0.500、6.667、1.111 g/500 mL,自然pH值,樣品與酶液之比為1∶10(g∶mL),酶液的溫度為(5±2) ℃,酶解時間2 h。對照處理采用20 g/L標準鹽水浸泡。

1.3.4 單因素試驗

在酶處理溫度(5±2) ℃，自然pH下,分別研究不同質(zhì)量濃度的酶液(0.25、0.5、0.75和1.00 mg/mL)、酶解時間(1、2、3、4和5 h)和料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12,g∶mL)對蝦體剝殼單位功的影響。

1.3.5 響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取酶解時間(A)、酶質(zhì)量濃度(B)、料液比(C)為響應因素,以剝殼單位功(mJ/g)為響應值,實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3.6 酶液的重復利用

為探究酶液的重復利用問題,每輪實驗結(jié)束后,取出3節(jié)蝦身,測定剝殼單位功,同時測定酶活性(初始和每輪處理后酶活性)和酶液的顏色。中性酶活性的測定采用中性酶活性檢測試劑盒,每組測2次,結(jié)果用U/mL表示。

1.3.7 蝦肉品質(zhì)測定

pH值:參考GB 5009.237—2016《國家食品安全標準 食品中pH值的測定方法》。每組取5 g蝦肉,加入45 mL蒸餾水,充分均質(zhì)后,靜置30 min過濾,取濾液測pH值,平行3次。

色澤的測定:根據(jù)XU等[12]的方法,測量蝦仁第2節(jié)腹側(cè)的L*、a*、b*值。每組6個平行,色差計事先用標準白板校正。

質(zhì)構(gòu)特性的測定:參考LI等[13]方法對蝦仁第2腹節(jié)做質(zhì)地多面分析(texture profile analysis,TPA)測試。將樣品置于平臺上,用直徑為4 mm的TA44圓柱形探頭進行兩循環(huán)咀嚼試驗,軸向壓縮距離(應變)：5 mm；觸發(fā)力,5 g；恒速測試,1.0 mm/s；返回速度為1.0 mm/s。獲取硬度(N)、彈性(mm)、咀嚼性和內(nèi)聚性等TPA參數(shù)。每組樣品8個平行。

肌肉組織微觀結(jié)構(gòu):參考LIN等[14]的方法,取蝦第1腹節(jié)肌肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊。4 ℃條件下固定24 h,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%)脫水,用二甲苯浸泡至透明后浸蠟,切片(橫截面和縱截面)。將切片平貼于載玻片上,烘干后進行蘇木精和伊紅染色,光學顯微鏡下觀察其肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,每組處理3次平行,結(jié)果為均值±標準差(SD)。以one-way ANOVA法及 Duncan 檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行組間比較和差異顯著性分析,顯著性水平定義為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶篩選結(jié)果

所用4種酶的適宜pH范圍均在6.5～8.0之間[15-16],考慮到pH對蝦肉品質(zhì)的影響,選擇自然pH,不同蛋白酶預處理后所需剝殼單位功如圖2所示。加酶處理能促進蝦剝殼,特別是中性蛋白酶,剝殼所用功為2.14 mJ/g,明顯低于對照和其他3種蛋白酶處理組(P<0.05)。中性蛋白酶是自然pH條件下具有很強活力的內(nèi)切酶,可催化殼、表皮及殼肉連接的蛋白質(zhì)肽鍵水解且催化反應速度快,破壞殼-肉之間的連接[9]。結(jié)合經(jīng)濟成本,選用中性蛋白酶對酶處理輔助剝殼工藝進行優(yōu)化。

1-對照;2-風味蛋白酶;3-動物蛋白水解酶;4-堿性蛋白酶;5-中性蛋白酶圖2 不同蛋白酶對剝殼單位功的影響Fig.2 Effect of different proteases on the peeling work注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶質(zhì)量濃度對剝殼的影響

中性蛋白酶的質(zhì)量濃度對蝦體剝殼的影響如圖3所示,質(zhì)量濃度從0.25 mg/mL增加到1 mg/mL時,剝殼所需單位功由6.24 mJ/g降低至1.37 mJ/g。說明隨著質(zhì)量濃度的增加,單位體積內(nèi)蛋白酶與蝦殼、表皮及殼肉連接的蛋白質(zhì)的接觸機會增加,水解作用增強[17],殼肉之間的緊密連接發(fā)生松動,剝殼所需的功減小。當質(zhì)量濃度超過0.5 mg/mL時,剝殼用功下降幅度減弱；質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,剝殼用功雖然減少(P<0.05),但實驗中觀察到蝦殼變脆弱,蝦殼是否完全剝掉,不僅依賴于殼肉連接的緊密性,而且與蝦殼的性質(zhì)相關(guān)[9],酶解過度會使蝦殼的強度降低,剝殼時蝦殼易破碎,部分蝦殼仍留在蝦肉上,影響剝殼的完整性。綜合經(jīng)濟效益考慮,確定合適的酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

圖3 酶的質(zhì)量濃度對于剝殼單位功的影響Fig.3 Effect of concentrations of protease on the peeling work

2.2.2 酶解時間對剝殼的影響

如圖4所示,在2 h內(nèi),蝦剝殼單位功顯著減少(P<0.05),其剝殼單位功為4.21 mJ/g,隨著時間的延長,剝殼所需單位功差異不顯著(P>0.05)。初始酶液中的酶量相對較高,與底物的充分接觸,使蝦殼-肉間松動的增加幅度較大,隨著反應的進行,酶被消耗,酶活力開始下降,剝殼單位功的減小趨于平緩(P>0.05),與酶解時間對秘魯魷魚環(huán)齒的脫離的影響具有相似性[18],所以合適的酶解時間為2 h。

圖4 酶解時間對于蝦剝殼單位功的影響Fig.4 Effect of enzymalysis time on the peeling work

2.2.3 料液比對剝殼的影響

在酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,處理時間為2 h的條件下,不同的料液比下對蝦剝殼影響如圖5所示,料液比為1∶2和1∶4(g∶mL)時,酶解對蝦殼-肉連接部分的作用有限,蝦殼基本不能完整地被剝除。此后,隨著料液比的減小,即酶液體積的增加,作用于樣品底物的酶量增加,酶解作用接觸位點增多,剝殼單位功減小,料液比超過1∶8時(g∶mL),剝殼用功差異不顯著(P>0.05),因此確定料液比為1∶8(g∶mL)。

圖5 料液比對蝦剝殼單位功的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the peeling work

2.3 響應面優(yōu)化分析

2.3.1 實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用響應面法對酶解時間(A)、中性蛋白酶的質(zhì)量濃度(B)、料液比(C)進一步優(yōu)化,采用 Box-Behnken 原理,以剝殼單位功(Y)為響應值設(shè)計實驗,根據(jù) Design-Expert 10設(shè)計試驗方案,結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

2.3.2 響應面模型的建立及方差分析

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.3 響應曲面交互作用分析

由圖6可知,酶解時間(A)和酶質(zhì)量濃度(B)交互作用的響應面坡度較陡,說明因素間的交互作用對剝殼單位功影響顯著,其等高線呈橢圓形,表示這2個因素間交互作用顯著；酶解時間(A)和料液比(C)、酶質(zhì)量濃度(B)和料液比(C)交互作用的響應面坡度較平緩,其等高線呈圓形,說明AC、BC因素間的交互作用剝殼單位功影響較弱,分析結(jié)果與表3具有一致性。

圖6 各因素交互作用對剝殼單位功影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour lines of interactions of various factors on the peeling work

2.3.4 模型的優(yōu)化和驗證

根據(jù)響應面優(yōu)化實驗的結(jié)果,結(jié)合實際生產(chǎn)中的操作和成本,確定的優(yōu)化值為：處理時間3.5 h、酶質(zhì)量濃度0.7 mg/mL、料液比1∶10(g∶mL),此時預測得到的剝殼單位功為2.61 mJ/g。為了驗證模型預測的準確性,用此優(yōu)化條件重復試驗3次,實際得到的蝦剝殼單位功為2.65 mJ/g,非常接近該二次回歸模型的預測值(>0.05),充分驗證了模型的準確性,因此,采用Design-Expert 10響應面分析法優(yōu)化得到的酶促脫殼條件參數(shù)準確可靠。

2.4 酶液的循環(huán)利用

酶液循環(huán)使用對剝殼單位功的影響如圖7所示。隨使用次數(shù)的增加,酶液活性呈下降趨勢,循環(huán)使用4次后,由初始的62.34 U/mL降為9.77 U/mL,而剝殼用功則由2.25 mJ/g增加為5.94 mJ/g,兩者的變化具有一致性；循環(huán)使用4次均無殼破碎粘連在蝦肉上,但循環(huán)使用3次后,酶液活性顯著下降至24.62 U/mL(P<0.05),剝殼單位功明顯增加。且隨循環(huán)使用次數(shù)增加,酶液顏色變黑,建議此酶液循環(huán)使用3次。

圖7 酶液循環(huán)使用輪數(shù)對酶活性和剝殼單位功的影響Fig.7 Effect of reusing of enzyme solution on proteolytic activity and peeling work

2.5 不同預處理剝殼對蝦仁品質(zhì)的影響

2.5.1 pH值和色澤

蝦體死后,體內(nèi)糖原降解影響肌肉pH值,所以通常把pH值作為判斷蝦體新鮮度的指標,且在pH值達到7.7前認為蝦肉質(zhì)量良好[19]。鮮蝦死后pH值為6.88,這與XU等[12]測定的蝦初始pH值 6.92相似。與鮮蝦相比,冷凍和酶解處理后的蝦仁pH值分別為6.80和6.78,差異不顯著(P>0.05),說明酶解剝殼對蝦肉鮮度影響不明顯,且得到的蝦肉質(zhì)量良好。色澤是影響消費者購買的主要因素[20]。冷凍和酶法剝殼處理可增加蝦仁L*,說明冷凍和酶處理均能增加蝦仁的亮度,這是由于冷凍-解凍過程中,肌肉組織細胞內(nèi)形成的冰晶融化、水分溢出引起的光吸收和光散射的變化[21]；部分蝦仁表皮可能被酶解,同樣殘留在表面的酶液也增加了光的反射作用。酶法處理對a*和b*影響與鮮蝦無異,冷凍后的蝦仁表面b*值為-2.61,與對照相比顯著增加(P<0.05)。綜合來看,酶處理對色澤的影響較小,可能是因為其處理時間相對較短且蝦體無凍結(jié),能保留產(chǎn)品原有的色澤。

表4 剝殼預處理對蝦pH值和色澤的影響Table 4 Effect of pretreatment on the pH and color of shrimps

2.5.2 對蝦仁質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)特性極大地影響了消費者的可接受性,因此在產(chǎn)品的加工中起重要作用[22]。冷凍和酶處理剝殼后蝦仁的質(zhì)構(gòu)參數(shù)如表5所示,蝦仁的硬度、彈性、內(nèi)聚性咀嚼性均有不同程度的變化。與鮮蝦相比,冷凍24 h后,蝦仁的硬度和咀嚼性顯著下降,彈性和內(nèi)聚性無明顯變化,可能是冷凍后解凍,大冰晶的形成及融化造成蝦肉纖維組織結(jié)構(gòu)被破壞[23],且由冷凍引起的肌原纖維蛋白的降解或結(jié)締組織的變化使持水性下降,蝦肉變軟[24-25]；而酶處理的蝦仁硬度只略微降低(P>0.05),這表明蛋白酶沒有過度水解蝦肉的肌原纖維和膠原蛋白,因為肌原纖維和膠原蛋白水解很大程度上會導致肌肉質(zhì)地軟化[26]；彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性均顯著低于鮮蝦,咀嚼性和冷凍24 h相差不明顯,咀嚼性是硬度、黏性、彈性結(jié)合起來的綜合性質(zhì),猜測是在處理過程中2%的鈉鹽的作用,能夠輕微降低肌肉的硬度并較大程度地降低咀嚼性[27]。

表5 剝殼預處理對蝦仁質(zhì)構(gòu)的影響Table 5 Effect of pretreatments on the texture of shrimps

2.5.3 對肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的影響

肌肉的微觀結(jié)構(gòu)是對蝦肌肉品質(zhì)變化的微觀表現(xiàn),能直接反映肌肉組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性[28]。新鮮蝦仁的肌肉組織排列整齊彼此緊密相連,肌內(nèi)膜表面光滑,呈典型的多邊型；肌束呈縱向排列,肌纖維排列致密,肌節(jié)豐滿,肌纖維束呈狹長柱狀(圖8-a1,圖8-a2)。冷凍24 h后剝殼的蝦仁,肌肉纖維之間的細胞外空間明顯增加,肌纖維的橫截面呈不同的碎裂形狀,肌內(nèi)膜和肌束膜破裂；此外,一些肌肉纖維不連貫,甚至出現(xiàn)斷裂,肌節(jié)受到機械損傷明顯(圖8-b1,圖8-b2),這表明由于冷凍形成的冰晶大分子對肌肉組織結(jié)構(gòu)的損傷較大。酶處理后的蝦仁,雖然肌肉細胞間的縫隙增大,但變化程度小于冷凍組；肌肉縱切面,肌纖維空隙略有增大,但并無出現(xiàn)大量斷裂現(xiàn)象,細胞維持著較好的完整性(圖8-c1,圖8-c2)。綜合來說,冷凍處理后剝殼對蝦仁肌肉結(jié)構(gòu)破壞較為明顯,酶處理后剝殼則相對較為輕微。

a1-鮮蝦橫切片;a2-鮮蝦縱切片;b1-冷凍剝殼橫切片;b2-冷凍剝殼縱切片;c1-酶促剝殼橫切片;c2-酶促剝殼縱切片圖8 剝殼預處理對蝦仁微觀結(jié)構(gòu)的影響(40×)Fig.8 Effect of pretreatments on microscopy of shrimp tissue

3 結(jié)論

自然pH值下,中性蛋白酶在對蝦便捷剝殼過程中發(fā)揮良好的酶促效果,所需剝殼單位功最少且剝殼效果好。優(yōu)化得到酶促剝殼條件為：酶質(zhì)量濃度0.7 mg/mL,料液比1∶10(g∶mL),酶解時間 3.5 h,在此條件下實驗得到的剝殼單位功為2.65 mJ/g,與理論預測值2.61 mJ/g基本一致,說明在該實驗范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準確有效,有一定的實用價值。該條件下酶液可重復使用3次,之后酶液活性減小至較低水平,且酶液顏色變暗。與鮮蝦仁相比,酶促剝殼對蝦仁pH及硬度影響不明顯,與冷凍剝殼后的蝦仁相比,b*與鮮蝦類似,顯著好于冷凍剝殼后的蝦仁,酶處理更能保持蝦肉的原有的色澤。微觀結(jié)構(gòu)觀察表明冷凍處理對蝦仁纖維破壞較為明顯,酶處理后的蝦肉肌纖維較為完整,排列相對緊密,沒有出現(xiàn)肌內(nèi)膜和肌纖維束斷裂的情況,說明酶促剝殼可顯著提高鮮蝦剝殼便捷性,保持蝦仁較好的品質(zhì),為促進對蝦機械剝殼的應用提供參考依據(jù)。