景 明，李繼影

(江蘇省蘇州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 蘇州 215004)

0 引言

預(yù)防和控制水傳播疾病是保障飲用水安全的基礎(chǔ)工作。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）和聯(lián)合國兒童基金會（UNICEF）的數(shù)據(jù)，目前世界上約每8 個人中就有一個人缺乏安全的飲用水[1]。在過去的一個世紀(jì)里，用水量的增長速度是世界人口增長速度的2 倍多，隨著飲用水需求量的增大，微生物污染成為飲用水安全的主要風(fēng)險之一。據(jù)統(tǒng)計，水傳播疾病在世界所有死亡率中占4%，在疾病死亡率中占5.7%。歐洲僅2007年就有8 個國家發(fā)生17例水安全事件[2]。我國2007年無錫太湖水體富營養(yǎng)化，導(dǎo)致無錫市區(qū)大范圍自來水含有異味，飲用水停用長達(dá)100 h[3]；2009年，內(nèi)蒙古赤峰市水傳播性污染事件，導(dǎo)致數(shù)千名居民患病[4]。

世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)為飲用水安全問題主要來源于微生物，檢測出微生物種類多達(dá)27 項。截止目前，世界上已有報道：飲用水中可能存在的病原微生物超過30 種[5]。我國飲用水執(zhí)行GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，該標(biāo)準(zhǔn)包含總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌、菌落總數(shù)、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲等共6 項微生物指標(biāo)。

通過對南方某鎮(zhèn)自來水中的微生物污染情況進(jìn)行檢測研究，旨在為飲用水安全管理提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA 提取

采樣時間為2020年9月3日，采樣地點為我國南方某鎮(zhèn)自來水管道。采集樣品體積為1 L，于冷藏條件下運回實驗室進(jìn)行樣品預(yù)處理。樣品先通過厚度為0.45 μm 的濾膜進(jìn)行過濾，再用PBS 緩沖液洗脫濾膜上的過濾物，體積最后濃縮至1.5 mL。采用CTAB 方法提取DNA 后，再通過瓊脂凝膠電泳分離后鑒定DNA 質(zhì)量。

1.2 高通量測序

取適量DNA 作為擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增區(qū)域為18S rRNA 的V4 區(qū)域[6]，擴(kuò)增引物使用帶Barcode 的特異引物，分別為18S V4-F∶GCGGTAATTCCAGCTCCAA，18S V4-R∶AATCCRAGAATTTCACCTCT。PCR 的反應(yīng)條件：95 ℃溫度條件下，保持5 min；94 ℃溫度條件下，保持60 s；57 ℃溫度條件下，保持45 s；72 ℃溫度條件下，保持60 s。共34 個循環(huán)，最后在72 ℃溫度條件下，再延長10 min，16 ℃溫度條件下，再延長5 min。用2%的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，用QIAGEN 公司提供的膠回收試劑盒對目的條帶回收產(chǎn)物。用TruSeqR DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建后再經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)存在干擾數(shù)據(jù)，為使結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data）[7]。根據(jù)Barcode 序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列后使用FLASH[8]對每個樣本的reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags 數(shù)據(jù)（Raw Tags）；再經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)（Clean Tags）[9]。

對處理后的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析。用Uparse軟件進(jìn)行聚類，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。用Mothur方法與SILVA138 軟件進(jìn)行OTUs 序列的物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs 進(jìn)行豐度和Alpha 多樣性計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

測序共得到91 755 條原始序列，過濾后得到64 703 條高質(zhì)量有效序列。對序列進(jìn)行抽樣，將得到的OTU 數(shù)量作稀釋曲線（Rarefaction Curve）；將OTUs 豐度排序與對應(yīng)的OTUs 的相對豐度作圖，得到等級聚類曲線（Rank Abundance）曲線見圖1。

圖1 不同樣品的稀釋曲線（a）與等級聚類曲線（b）

由圖1 可以看出，本次測序得到的稀釋曲線與等級聚類曲線趨于平緩，證明測序得到的結(jié)果能反應(yīng)樣品中絕大部分細(xì)菌的生物信息。

物種數(shù)量是測序得到的物種數(shù)目（即OTUs 數(shù)目）。Shannon-Wiener 指數(shù)是樣品中的分類總數(shù)及其占比。群落多樣性越高，物種分布越均勻，該數(shù)值就越大。Simpson 指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，該值越大表示OTU 對應(yīng)的物種分配越均勻。

測序Alpha 多樣性計算見表1。

表1 Alpha 生物多樣性指數(shù)

本研究中的Shannon-Wiener 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映出樣品中物種分布較不均勻。Chao1 指數(shù)是估計群落樣品中包含的物種總數(shù)，ACE 指數(shù)是估計群落中OTU 數(shù)目。這2 個值越大表示測序得到的物種數(shù)越多。由表1 可以看出，本研究中這2 個值均較大，表明物種數(shù)較多，生物多樣性較為豐富。

2.2 自來水中的細(xì)菌多樣性分析

本次測序得到的1 016 個OTUs 分類結(jié)果顯示：共有37 個不同門的細(xì)菌。前8 個門的相對豐度見圖2。由圖2 可以看出，變形菌門（Proteobacteria）的占比最大為84.4%，其次為擬桿菌門（Bacteroidota）占比為5.5%，酸桿菌門（Acidobacteriota）占比為1.9%。任紅星[10]在對中國某中部城市飲用水廠中微生物多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)，變形菌門是飲用水中的優(yōu)勢種，占飲用水中微生物的50%～97%。侯鸞鳳[11]在對南方某自來水廠的微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，主要優(yōu)勢菌為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，與本研究結(jié)果有所不同。

圖2 自來水樣品在門水平的細(xì)菌組成及占比

變形菌門（Proteobacteria）是水環(huán)境中最普遍存在的原核生物，包括光和營養(yǎng)型、化能自養(yǎng)型和化能異養(yǎng)型細(xì)菌3 大類[12]。為了解主要門類細(xì)菌的物種組成，對變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）的組成進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖3 和圖4。

圖3 自來水樣品變形菌門基于綱水平（a）和目水平（b,c）的組成

圖4 自來水樣品擬桿菌門（Bacteroidota）基于綱水平（a）和目水平（b）的組成

由圖3 可以看出，本次檢測出的變形菌門（Proteobacteria）包括β-變形菌綱（Gammaproteobacteria，占比為92%）和δ-變形菌綱（Alphaproteobacteria，占比為8%）2 個綱。其中β-變形菌綱（Gammaproteobacteria）主要由伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales，占比為53%）和假單胞菌目（Pseudomonadales，占比為44%）組成；δ-變形菌綱（Alphaproteobacteria）則主要由根瘤菌目（Rhizobiales，占比為51%）、柄桿菌目（Caulobac－terales，占比為28%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomon－adales，占比為12%）和（Azospirillales，占比為3%）組成。

由圖4 可以看出，本次檢測的擬桿菌門（Bacteroidota）幾乎全部為擬桿菌綱（Bacteroidia，占比接近100%），而擬桿菌綱（Bacteroidia）則主要由(Chitinophagales，占比為9%)、噬纖維菌目（Cytophagales，占比為7%）、（Flavobac－teriales，占比為10%）和鞘脂桿菌目（Sphingobacter－iales，占比為74%）4個目組成。

2.3 自來水中的病原菌及其潛在風(fēng)險分析

自來水中微生物安全風(fēng)險主要來源于病原菌，研究重點對病原菌進(jìn)行分析。已被研究認(rèn)定為病原菌的類別可參考相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]。樣品中測出的6 種病原菌屬共占總生物量的33.66%，詳見表2。侯鸞鳳[11]的研究發(fā)現(xiàn)，條件致病菌占飲用水總生物量的40%以上。本研究測出的病原菌在總生物量的占比略低于以往研究報道。

表2 樣品中測出的病原菌（基于屬水平）

值得注意的是，檢測出本研究中不動桿菌屬（Acinetobacter）的含量較高，占總生物量的33.26%，占變形菌門的39.39%。不動桿菌屬（Acinetobacter）屬于條件致病菌，雖尚沒有關(guān)于人群因飲用含不動桿菌屬細(xì)菌的飲用水而引起胃腸道感染的證據(jù)，但有可能通過飲用水引起易感個體的非胃腸道感染的傳播[16]。

3 結(jié)論

（1）采樣點自來水中共監(jiān)測出37 個門72 個綱、156 個目、202 個科、280 個屬的原核生物。其中主要細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroi-dota），累計占總生物量的89.9%。檢測出的6 種病原菌屬于常見致病菌，分別為氣單胞菌屬（Aeromonas）、大腸志賀氏桿菌（Escherichia-Shigella）、軍團(tuán)桿菌（Legionella）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）和分枝桿菌（Mycobacterium）。周昭彥等[17]對上海市14 所醫(yī)院自來水中潛在病原菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為100%，其中分支桿菌最多，假單胞菌屬次之。HUANG J 等[18]對中國東部地區(qū)自來水廠及管道中的病原微生物進(jìn)行檢測，通過培養(yǎng)法檢測出大腸菌群濃度為1 700～2 300 L-1，但通過qPCR 監(jiān)測出大量病原微生物，主要為軍團(tuán)桿菌和分枝桿菌，菌群濃度分別為5.33 和4.87 mL-1。本研究自來水中病原菌主要為不動桿菌屬（Acinetobacter），占總生物量的33.26%，屬于病原菌中的優(yōu)勢菌。

（2）近年來，由于不動桿菌屬（Acinetobacter）抗生素的耐藥性增加被引起廣泛關(guān)注。據(jù)報道，不動桿菌屬（Acinetobacter）易引起醫(yī)院、社區(qū)的感染[19]。雖然不動桿菌屬（Acinetobacter）是一種常見的微生物，但關(guān)于這類病原菌在食品或飲用水中的傳播情況卻極少報道。不動桿菌屬（Acinetobacter）革蘭氏陰性，不產(chǎn)孢子、不發(fā)酵，屬于嚴(yán)格需氧微生物。VAN A 等[21]在比利時自來水生產(chǎn)及管道傳輸中檢測出大量不動桿菌，豐度高達(dá)47.5%。這與本研究結(jié)果有一定的相似性，需對其可能引起的微生物風(fēng)險給與高度重視，建議在該區(qū)域選擇合適的飲用水滅菌方式對經(jīng)過管道運輸?shù)娘嬘盟M(jìn)行末端再處理，以保障飲用水安全。