顧胤燁，張 玨，石 磊

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗科， 上海 201203)

患者長期罹患慢性炎癥，眾多的炎癥因子對胰島B細(xì)胞的損傷，誘發(fā)胰島素抵抗是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)生的一個重要機(jī)制[1,2]。有研究[3]指出，炎癥最主要的損傷是累及人體先天免疫功能，通過先天性免疫細(xì)胞釋放炎癥因子進(jìn)一步誘發(fā)胰島素抵抗，最終形成糖尿病。 但是，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，免疫因素調(diào)節(jié)在 2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[4]。 T細(xì)胞免疫球蛋白以及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain protein-3，TIM-3)屬于表達(dá)重要的免疫細(xì)胞因子，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，在感染性疾病患者以及腫瘤患者中可以通過影響T細(xì)胞功能而進(jìn)一步起到免疫耐受的作用[5]。但是 T細(xì)胞免疫球蛋白以及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3在 2型糖尿病患者中的表達(dá)和具體的調(diào)控作用的研究較少。本研究通過探討T細(xì)胞免疫球蛋白以及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3在 2型糖尿病患者中的表達(dá)和對CD4+和CD8+T細(xì)胞功能的影響，為兩種蛋白對 2型糖尿病患者T細(xì)胞功能的具體作用機(jī)制的闡述提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究選取2017年1月至2019年12月在本院的內(nèi)分泌科就診的72例2型糖尿病患者作為糖尿病組，其中男38例，女34例，平均年齡(60.3±9.7)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.7±3.1)kg/m2。并將糖尿病組患者分為亞組，經(jīng)抗體刺激組36例和無抗體刺激組36例，經(jīng)抗體刺激組男21例，女15例，平均年齡(61.4±8.5)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.9±3.3)kg/m2；無抗體刺激組男17例，女19例，平均年齡(59.2±9.9)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.5±3.0)kg/m2。兩組患者的一般資料的差異具有可比性。糖尿病組納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲≤年齡<75歲；均符合世界衛(wèi)生組織對2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；不合并其他重大器官損傷；資料齊全；自愿參加本研究并對研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病患者；合并2型糖尿病的急性并發(fā)癥患者；合并腫瘤的患者；合并嚴(yán)重的感染及炎癥反應(yīng)的患者；合并服用對血糖有影響的藥物的患者；合并精神類疾病的患者。同期進(jìn)行健康體檢者55例作為對照組。健康體檢者的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18歲≤年齡<75歲；資料齊全；不合并其他器官的重大疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤的患者；合并精神類疾病的患者；不愿參加本研究的患者。

1.2方法:比較兩組患者的血糖相關(guān)指標(biāo)，包括空腹血糖、糖化血紅蛋白、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素B功能指數(shù)；比較兩組患者TIM-3的表達(dá)情況，比較兩組患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子相對量。進(jìn)一步比較通過抗TIM-3抗體刺激對糖尿病患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子相對量。其中，T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子包括CD4+T細(xì)胞的分泌細(xì)胞因子：白介素-4(Interleukin-4，IL-4)，IL-10，IL-17，IL-22，IL-35，干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，CD8+T細(xì)胞的分泌細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor - α，TNF-α)，IFN-γ。T細(xì)胞制備及檢測： 制備外周血單個核細(xì)胞，清晨，取外周血5mL，采用淋巴細(xì)胞分離液以及密度梯度離心法分選外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，將其儲存在液氮中備用。檢測T細(xì)胞中的TIM-3的表達(dá)，取PBMC細(xì)胞，置入熒光激活細(xì)胞分類儀(fluorescent-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)管中，洗滌后加入抗CD8-APC、抗CD4-FITC、抗TIM-3-PE，在適宜的避光孵育，再通過多聚甲醛進(jìn)行固定，采用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測，采用相關(guān)的軟件進(jìn)行分析。T細(xì)胞的純化和培養(yǎng)，采用CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞分選試劑盒，采用磁珠分離法對CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞進(jìn)行純化。具體方法為：取107個PBMC，離心后去掉上清，加入緩沖液，再加入生物素標(biāo)記的抗體雞尾酒，在適宜的溫度下孵化。再加入CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞免疫磁珠，再繼續(xù)在適宜的溫度下孵育。再使用緩沖液沖洗分離柱，并置于磁力分離架上，并將細(xì)胞懸液置于分離柱上，通過分離柱純化CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞。抗TIM-3抗體刺激：在通過含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，再向培養(yǎng)基中加入抗TIM-3抗體，培養(yǎng)12h以后，收集上清液和細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞因子測定：采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)對上清液中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，其中包括腫瘤壞死因子(TNF-α)，IFN-γ，IL-10，IL-17，IL-22，IL-35，IL-4，具體的操作步驟均按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1比較兩組T細(xì)胞中的TIM-3含量的變化:糖尿病組患者的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的含量均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組T細(xì)胞中的TIM-3含量的變化

2.2比較兩組CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化:糖尿病組患者的INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22含量顯著低于對照組，糖尿病組患者的IL-10、IL-35含量高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化

2.3比較兩組CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化:糖尿病組TNF-α、INF-γ的含量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化

2.4是否經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激對CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化:經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后的糖尿病患者INF-γ、IL-17、IL-22的含量明顯高于無抗體刺激糖尿病患者，經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后糖尿病患者IL-35的含量明顯低于無抗體刺激糖尿病患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 抗TIM-3抗體刺激對CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化

2.5是否經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激對CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化:經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后的糖尿病患者TNF-α、INF-γ含量高于無抗體刺激糖尿病患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 抗TIM-3抗體刺激對CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的含量變化

3 討 論

2型糖尿病發(fā)生的主要機(jī)制是胰島素抵抗，胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展主要涉及胰島素與其受體結(jié)合的相互作用，最關(guān)鍵的機(jī)制是胰島素受體信號傳導(dǎo)通路的損傷[6]。有研究[7]證實，胰島素受體的信號通路與炎癥因子的信號存在交叉作用，與T細(xì)胞等細(xì)胞亦存在密切的聯(lián)系，因此，研究糖尿病患者T細(xì)胞功能改變對治療糖尿病至關(guān)重要，T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3是主要影響T細(xì)胞功能的蛋白，本研究主要探討T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3對2型糖尿病患者T細(xì)胞的影響，以期為臨床治療糖尿病提供科學(xué)基礎(chǔ)。

TIM-3的主要功能是抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活性并進(jìn)一步降低炎癥因子的分泌，與健康的體檢者相比，糖尿病患者自然殺傷細(xì)胞T細(xì)胞以及T細(xì)胞表面TIM-3的表達(dá)量均明顯提升[8]。TIM-3可以有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞中低密度脂蛋白致使形成斑塊，而且TIM-3與諸多的疾病有關(guān)，但是，尚未見TIM-3在糖尿病患者中的相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，與正常的對照組相比，糖尿病患者CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中的TIM-3陽性細(xì)胞的比例明顯升高。許多的慢性疾病以及惡性腫瘤患者均合并T細(xì)胞功能不全以及功能衰竭等癥狀，致使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生免疫耐受，使其不能進(jìn)一步殺傷病原體以及腫瘤細(xì)胞，使得機(jī)體內(nèi)的感染嚴(yán)重惡化，腫瘤異常生長[9]。有動物實驗研究證實[10]，CD4+T細(xì)胞亞群的功能抑制會促使巨噬細(xì)胞的分化方向不同，炎性細(xì)胞Th1以及Th17的比例嚴(yán)重升高，可進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞向炎性巨噬細(xì)胞分化，并提升其炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素家族的提升，以及腫瘤壞死因子和干擾素等與炎癥相關(guān)的因子。

T細(xì)胞亦與胰島素的合成存在密切的聯(lián)系，T細(xì)胞的活性提升以及功能的改變均可能會進(jìn)一步影響糖尿病患者病情。而在糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞會發(fā)生異?；罨约爱惓Ｔ鲋?，主要表現(xiàn)為Th1和Th17細(xì)胞應(yīng)答降低最為明顯，而Treg細(xì)胞的應(yīng)答明顯增強(qiáng)，CD8+T細(xì)胞的作用降低，這一系列的研究均明確的提升在糖尿病患者中T細(xì)胞的功能降低。與以往的其他慢性疾病的研究存在一定的差異，可能的原因是與本研究的納入的樣本量較少，或者糖尿病患者的病情較輕等原因，這一系列的研究均需要更大樣本量，以及體內(nèi)的研究加以驗證。

本研究在后續(xù)的研究中也對TIM-3蛋白的活性加以抑制，探討其對糖尿病患者T細(xì)胞的影響，研究結(jié)果提示，在加入了抗TIM-3抗體后，患者的Th1、Th17細(xì)胞的活性均顯著的提升，CD8+細(xì)胞的活性亦明顯提升，但是卻對Tregs的調(diào)節(jié)功能的影響較小。

綜上所述，在糖尿病患者中T細(xì)胞表面黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3的表達(dá)量提升，含量會升高，其可能參與了2型糖尿病患者T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，但是具體的機(jī)制尚需深入研究。