趙春燕， 唐嘉迎

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院, 重慶 大足區(qū) 402360)

食管癌(EC)是嚴(yán)重的消化道惡性腫瘤，居全球常見癌癥第八位，也是癌癥導(dǎo)致死亡的第六大病因，而我國EC高發(fā)，發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的50%，EC早期發(fā)病癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)期[1]。目前，外科手術(shù)治療EC效果仍不能令人滿意，且只有30%～40%的患者可以接受手術(shù)[2]。不論EC患者出于何種原因不能采用手術(shù)治療，局部放化療無疑為其提供最佳選擇，但研究表明，不同患者對放療和化療敏感性不同，該手段治療患者的5年生存率僅為26%，復(fù)發(fā)率高，缺乏有效的預(yù)后生物標(biāo)志物是食管癌高死亡率的原因[3]。黏蛋白3(Tim-3)是T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白家族中重要成員，Tim-3不僅介導(dǎo)T細(xì)胞相關(guān)免疫應(yīng)答，在多種癌癥組織中均能被檢測到，與腫瘤的免疫逃逸、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，已在抗腫瘤領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4]。為探討Tim-3與EC放化療敏感性的相關(guān)性，本研究通過檢測并分析Tim-3在EC患者腫瘤組織及外周血Tim-3表達(dá)情況，以期找到影響EC放化療敏感性新的標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年1月至2019年12月期間就診我院的首次確診EC的患者為研究對象，收集其病理標(biāo)本及病理資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：①按照國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第七版)進(jìn)行EC分期[5]，符合Ⅲ、Ⅳ期標(biāo)準(zhǔn)；②EC首診患者，未出現(xiàn)食管穿孔；③對放療和化療均能耐受；④無其他功能器官障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤者；②既往接受過手術(shù)、放療或化療者；③并發(fā)嚴(yán)重代謝類疾病者。④不能按照方案要求配合研究者。共有78例EC患者符合要求，分為TNM Ⅲ期49例和Ⅳ期29例，其中47例為男性患者，其他31例為女性，平均年齡(66.47±16.38)歲。

1.2治療方法:參照《食管癌規(guī)范化診療指南(2013年版)》并結(jié)合患者情況，對納入的患者采用同步放化療方法進(jìn)行治療[6]?；煼桨福翰捎肞F方案，按500mg/m2劑量靜滴5-氟尿嘧啶，第1～5天；按40mg/m2靜滴順鉑，第1天。共需治療2個(gè)療程，每個(gè)療程28d。放療方案：采用(3DCRT/IMRT)常規(guī)分割方案，每日進(jìn)行一次，單次劑量為1.8～2.0Gy，一周5次，總劑量為46Gy。放療第1天給予第一周期化療，直至第28天評估患者放療反應(yīng)后給予第二周期化療。同時(shí)放化療結(jié)束間隔1個(gè)月，復(fù)查食管鋇餐造影和胸腹部CT，根據(jù)復(fù)查結(jié)果評價(jià)近期療效。根據(jù)患者情況，繼續(xù)鞏固3～4個(gè)周期化療后進(jìn)行復(fù)查和隨訪，評估治療效果。

1.3療效評估及分組[6]:參照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)評估近期治療效果，評估內(nèi)容見表1。根據(jù)治療有效情況將所有患者分為放化療敏感組和抗拒組，療效評估為CR和PR患者納入為敏感組，SD和PD患者則納入為抗拒組。

表1 療效評估標(biāo)準(zhǔn)

1.4免疫組化法檢測Tim-3

1.4.1標(biāo)本檢測[7]:采用免疫組化法分析EC患者的Tim-3在EC組織和癌旁組織表達(dá)情況。方法：將癌旁和癌癥組織的蠟塊制成石蠟切片，厚度為4μm，60℃條件下加熱切片后，對石蠟切片進(jìn)行脫蠟脫苯處理，之后用過氧化氫溶液浸泡15min，以使內(nèi)源性過氧化物酶失活；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3min，但不能直接沖刷組織；之后采用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液浸泡修復(fù)抗原；再次重復(fù)PBS洗滌步驟，室溫條件下染色處理約2h；用PBS再次洗滌，將通用型二抗滴在切片上，于室溫條件孵育15min左右，用PBS再次洗滌；所有切片在室溫下用DAB顯色液處理約5min，再次用PBS洗滌后，用蘇木精及伊紅進(jìn)行復(fù)染；最后脫水處理，封片，顯微鏡閱片并拍照。

1.4.2結(jié)果判定[7]:每張切片以細(xì)胞染色強(qiáng)度及染色比例作為評分標(biāo)準(zhǔn)，并由至少2名病理學(xué)領(lǐng)域?qū)＜疫M(jìn)行評分。①染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分。②癌細(xì)胞染色比例評分標(biāo)準(zhǔn)：染色≤5%為0分，>5%且≤25%為1分，>25%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分。最后以染色強(qiáng)度評分和比例評分的乘積進(jìn)行綜合評價(jià)，分?jǐn)?shù)介于0～12分，0～3分則判定為低表達(dá)，4～12分則為高表達(dá)。

1.5外周血Tim-3表達(dá)水平測定[8]:清晨空腹采集患者外周血5mL，經(jīng)稀釋后，采用Ficol-Hypaque密度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，3000轉(zhuǎn)/分離心力離心20min后，吸取上清液中白膜層，加入含有PBS的離心管中混勻，再以2000轉(zhuǎn)/分離心10min，去上清液即得PBMCs。取3MIU PBMCs加入流式CD16、CD56和Tim-3以及單標(biāo)和同型對照標(biāo)志物，取4%多聚甲醛溶液500μL固定后上機(jī)檢測，所用儀器為FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson 公司)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；組間計(jì)數(shù)資料應(yīng)用卡方(χ2)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析Tim-3蛋白表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系；采用COX回歸考察影響EC預(yù)后的危險(xiǎn)因素；繪制Tim-3對EC預(yù)后的ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者病理資料比較:經(jīng)同步放化療后，36例EC患者緩解，納入為敏感組，42例患者治療效果不理想，納入為抗拒組。經(jīng)比較，敏感組的外周血Tim-3水平顯著低于抗拒組(P<0.05)，兩組患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期均不具有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 兩組患者病理資料比較

2.2Tim-3蛋白表達(dá)情況:Tim-3蛋白在癌旁組織和EC組織中都有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，著色情況見圖1。但Tim-3在EC組織中高表達(dá)為67例(85.90%)，而癌旁組織中輕度表達(dá)為8例(10.26%)，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，詳見表3。

表3 Tim-3蛋白表達(dá)情況n(%)

圖1 Tim-3的免疫組化結(jié)果(×20)，A.癌旁組織;B.EC組織

2.3EC患者Tim-3與病理參數(shù)的關(guān)系:EC組織中Tim-3的異常表達(dá)在浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有顯著差異(P<0.05)，而Tim-3的表達(dá)與性別和年齡無明顯關(guān)系，且對腫瘤大小及其分化程度亦無顯著影響(P>0.05)，結(jié)果見表4。

表4 EC患者Tim-3與病理參數(shù)的關(guān)系

2.4Tim-3與EC患者預(yù)后的關(guān)系:Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步評估Tim-3蛋白表達(dá)與EC患者總生存時(shí)間(OS)及無病生存時(shí)間(DFS)的關(guān)系。結(jié)果可知，高表達(dá)的Tim-3的患者具有更低的OS及DFS(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

圖2 Tim-3與EC患者預(yù)后的關(guān)系

2.5COX回歸分析:以EC患者的放化療敏感性為因變量，自變量包括外周血Tim-3水平(高表達(dá)=1，低表達(dá)=0)、浸潤深度(高浸潤=0，低浸潤=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=0，否=1)及TNM分期(Ⅲ期=0，Ⅳ期=1)，進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果Tim-3高表達(dá)(HR=4.253，95%CI 1.464～12.353)是影響EC患者放化療敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果見表5。

表5 COX回歸分析

2.6外周血Tim-3水平與EC放化療敏感性的ROC曲線:為進(jìn)一步確定外周血Tim-3水平與EC患者放化療的敏感性，以放化療敏感賦值為1，放化療抗拒賦值為0，以7.20ng/mL作為預(yù)測的臨界值，繪制ROC曲線。結(jié)果ROC曲線下面積為0.848，預(yù)測的靈敏度為86.2%，特異度為76.3%。詳見圖3。

圖3 外周血Tim-3水平與EC放化療敏感性的ROC曲線

3 討 論

EC早期發(fā)現(xiàn)是可以根治的，盡管醫(yī)學(xué)專家做了很多努力，但限于目前診療技術(shù)，仍有90%確診患者為中晚期，5年生存率低于20%[9]。因此，當(dāng)前任務(wù)是有效提高中晚期EC患者的治療效果。近年來興起的新輔助放化療(NCRT)聯(lián)合手術(shù)已逐漸成為局部進(jìn)展期EC的標(biāo)準(zhǔn)治療模式，但不同患者表現(xiàn)出放化療敏感性迥異，EC復(fù)發(fā)率及預(yù)后效果仍有待改善[3]。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，為EC早期診斷、預(yù)后預(yù)測提供更多可能，有望從中找到預(yù)測EC放化療敏感性的潛在標(biāo)志物[10]。

Tim-3是一種負(fù)調(diào)節(jié)性免疫蛋白，在不同類型的免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，包括T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和肥大細(xì)胞，在食管癌、胃癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞上也有發(fā)現(xiàn)，已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤治療領(lǐng)域。研究表明[11]，Tim-3蛋白主要表達(dá)于EC組織，陽性率高達(dá)80%以上，而癌旁組織明顯更低，認(rèn)為Tim-3表達(dá)水平可能與EC患者的預(yù)后有關(guān)，但有關(guān)Tim-3與EC相關(guān)性的報(bào)道較少，其結(jié)論有待驗(yàn)證。而本研究通過免疫組化法測定Tim-3蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Tim-3蛋白在癌旁組織和EC組織中都有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。但Tim-3在EC組織中高表達(dá)為85.90%，而癌旁組織中輕度表達(dá)為10.26%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，通過對比不同Tim-3表達(dá)水平患者的病理參數(shù)發(fā)現(xiàn)，TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3個(gè)參數(shù)表現(xiàn)出明顯差異(P<0.05)，且Tim-3蛋白異常高表達(dá)患者OS及DFS明顯縮短，提示Tim-3可能通過高表達(dá)影響腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及癌癥進(jìn)展，導(dǎo)致疾病惡化，這與既往研究[11]結(jié)論基本一致，Tim-3可能與微環(huán)境中CD8+、PD-1+及T細(xì)胞作用促進(jìn)腫瘤浸潤，其可以在食管癌患者T細(xì)胞表面表達(dá)，從引起T細(xì)胞功能疲乏，發(fā)揮免疫抑制作用，并且可誘導(dǎo)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致疾病進(jìn)展惡化，TNM分期升高。

腫瘤細(xì)胞依賴腫瘤微環(huán)境而生存，在這環(huán)境中還存在跟腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、髓源抑制性細(xì)胞(MDSCs)等，對機(jī)體發(fā)揮著免疫抑制作用，加重腫瘤的浸潤[12]。而楊惠雲(yún)等[13]通過檢測腫瘤組織及外周血來源的Tim-3表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，Tim-3可通過與MDSCs配體結(jié)合，增加MDSCs的免疫抑制功能。喻雪琴等[9]也發(fā)現(xiàn)，外周血PBMCs表面Tim-3高表達(dá)可能會(huì)降低免疫細(xì)胞的免疫狀態(tài)，誘發(fā)免疫耐受，從而使疾病發(fā)展走向慢性。本研究發(fā)現(xiàn)，放化療抗拒患者的外周血Tim-3水平明顯高于敏感組患者(P<0.05)，提示Tim-3可能在EC患者放化療敏感性研究中發(fā)揮作用，但相關(guān)研究較少，其作用機(jī)制可能與MDSCs協(xié)同作用介導(dǎo)的免疫逃逸有關(guān)。另外，Tim-3還可能通過以下機(jī)制介導(dǎo)腫瘤免疫抑制：①與微環(huán)境中CD8+、PD-1+及T細(xì)胞作用促進(jìn)腫瘤浸潤，具有顯著的耗竭特征；②在DC細(xì)胞上表達(dá)，抑制因腫瘤DNA誘導(dǎo)的機(jī)體損傷恢復(fù)模式的激活；③在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，可以促進(jìn)MDSCs分化增值，從而抑制腫瘤免疫。但關(guān)于外周血Tim-3表達(dá)與EC放化療敏感性研究很少，有待進(jìn)一步研究證實(shí)其作用機(jī)制。

癌癥作用機(jī)理復(fù)雜，EC的影響因素很多，與地域、年齡、外部環(huán)境等有關(guān)系。而本文COX回歸分析顯示，外周血Tim-3高表達(dá)(HR=4.253，95%CI 1.464-12.353)是影響EC患者放化療敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但可能因樣本選取及病例數(shù)相對較少的問題，未能發(fā)現(xiàn)其他顯著影響EC患者放化療敏感性的因素。為進(jìn)一步確定外周血Tim-3水平與EC患者放化療的敏感性，通過繪制ROC曲線，結(jié)果Tim-3的臨界值為7.20ng/mL，ROC曲線下面積為0.848，預(yù)測的靈敏度為超過85%，特異度也超過75%，說明外周血Tim-3與EC放化療敏感性具有較強(qiáng)相關(guān)性。

由此可知，放化療抗拒EC患者癌癥組織及外周血Tim-3蛋白高表達(dá)，與EC病理參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān)，且外周血Tim-3與EC放化療敏感性存在一定的相關(guān)性，提示Tim-3可作為EC預(yù)測的敏感標(biāo)志物。但EC作用機(jī)制復(fù)雜，尚未明確Tim-3對EC的作用機(jī)制，仍有待后續(xù)加大樣本量更加深入的研究。