趙廣平， 陳永學(xué)， 甄書青， 侯俊德， 劉 飛

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科， 河北 邯鄲 056001)

高血壓腦出血是高血壓人群常見疾病之一，其發(fā)病率和致殘率均較高，我國發(fā)病率約為17.1%～55.4%，現(xiàn)已成為我國第一大致殘因素和第三大致死疾病[1]。研究表明，腦出血后血腫周圍腦組織存在著逐漸加重的腦水腫和腦組織缺血半暗帶損傷區(qū)，及時(shí)有效的手術(shù)干預(yù)對(duì)于減少病死率和提高患者的生活質(zhì)量具有積極意義[2]。隨著手術(shù)方式的不斷改進(jìn)，近年來以神經(jīng)內(nèi)鏡技術(shù)為主的微創(chuàng)手術(shù)開始受到廣泛關(guān)注，全麻下行開顱顯微手術(shù)取得良好療效。靶控靜脈麻醉是一種通過調(diào)節(jié)作用藥物濃度控制麻醉深度的麻醉方式，能有效減少患者應(yīng)激反應(yīng)，減輕血流動(dòng)力學(xué)影響[3]，但有關(guān)麻醉方式對(duì)腦出血病灶區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞的研究仍鮮有報(bào)道。本研究旨在通過構(gòu)建自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型，在動(dòng)物模型上探究不同麻醉方式對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的影響，明確不同麻醉方式對(duì)腦出血病灶的直接影響，從而為指導(dǎo)臨床提供可靠參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:30只健康自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，雌雄各半，體重 250～300g，均于SPF級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50～60%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，期間自由飲水，自由攝食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑:Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司)；Trizol裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(美國Invitrogen公司)；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均(日本TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2體抗單克隆抗體、鼠抗人Bax體抗單克隆抗體、鼠抗人Caspase-3體抗單克隆抗體(美國Abcam公司)；Tunel試劑盒(美國Roche公司)；PBS磷酸鹽緩沖液、蛋白上樣緩沖液(中國上海碧云天生物工程研究所)。

1.2方 法

1.2.1動(dòng)物分組與模型構(gòu)建:所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，術(shù)前12h禁食，4h禁水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型[4]：大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，根據(jù)圖譜定位大鼠右側(cè)尾殼核，于此處采用牙科制備直徑約1.5mm的圓孔，至硬腦膜表面。采用微量注射器抽取股動(dòng)脈新鮮動(dòng)脈血液50μL，經(jīng)鉆孔垂直注入腦。分次退針，醫(yī)用骨蠟封閉，觀察無血液溢出后，縫合、包扎。模型構(gòu)建成功后，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成兩組，每組15只，分別麻醉A組和麻醉B組。采用3%戊巴比妥(65mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠生效后，給予氣管插管后機(jī)械通氣。麻醉A組大鼠術(shù)中分次經(jīng)尾靜脈推注芬太尼+2.5%七氟烷維持麻醉；麻醉B組大鼠術(shù)后給予1.5ng/mL舒芬太尼+2.5μg/mL丙泊酚靶控靜脈持續(xù)輸注維持麻醉。分別于造模術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h，每組隨機(jī)取3只大鼠處死取腦，去除低位腦干、前方嗅球和后方小腦，4%多聚甲醛固定待用。

1.2.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:各組大鼠分別于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h進(jìn)行Bederson's神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[5]：以行為均正常記0分；以提鼠尾離地約1尺，手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收記1分；以推大鼠雙肩，手術(shù)對(duì)側(cè)抗力下降記2分；觀察大鼠在水平面行走情況，以圍繞健側(cè)轉(zhuǎn)圈記3分；以不能自主活動(dòng)記4分。分?jǐn)?shù)越高說明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.3腦組織含水量檢測(cè):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取腦后，去除小腦及腦干，稱量濕重，將樣本置于80℃恒溫箱中干燥，48h后稱量樣本干重，根據(jù)公式：腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.4TUNEL染色法檢測(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織4%多聚甲醛固定過夜后予以雙蒸水沖洗、脫水、脫酒精、氯仿透明后浸蠟、石蠟包埋后制成蠟塊，制備厚度為2～3μm切片，使用In Situ Cell Death Detection Kit進(jìn)行TUNEL染色，滴加TUNEL反應(yīng)液50 μL(Enzyme solution及Label Solution按1∶9配制，即用即配，冰上操作)，保濕、避光、37℃孵育60min；PBS漂洗后，滴加DAPI至完全覆蓋細(xì)胞以復(fù)染核；再次漂洗后，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上，將爬片倒扣在滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上封片，于400×顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.5免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)情況:取保存于多聚甲醛中的腦組織，采用脫水機(jī)進(jìn)行自動(dòng)脫水處理，隨后采用包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋處理，冰凍后制備連續(xù)切片，每片厚度約為2.0μm。將切片置于二甲苯及梯度酒精中依次浸泡脫蠟、脫水，使用PBS洗滌3次，于切片上滴加枸櫞酸鈉緩沖溶液。滴加10%山羊血清進(jìn)行封閉處理，干燥后，滴加Bax、Bcl-2及Caspase-3單克隆抗體4℃孵育過夜。37℃孵育二抗1h，PBS洗滌3次，采用DAB化學(xué)發(fā)光劑顯影。自來水沖洗后，蘇木素復(fù)染30s。沖洗后將切片至于梯度酒精進(jìn)行脫水處理。隨后置于梯度二甲苯溶液中進(jìn)行透明處理。隨后使用中性樹脂覆蓋玻片進(jìn)行封固。于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統(tǒng)計(jì)，觀察不同組別樣本中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。

1.2.6RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平:腦組織細(xì)胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，68℃ 60s，40個(gè)循環(huán)，最后95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s收集熒光信號(hào)，計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，相對(duì)定量分析按照2-[△△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△△CT(對(duì)照組)]求出Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內(nèi)參GAPDH印物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.7Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達(dá)水平:大鼠腦組織每例約50mg，加入組織蛋白提取液，置于冰盒中，充分碾磨，10000r/min離心10min取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。各組以30～60μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后，使用半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用5%脫脂牛奶封閉1h，使用抗Bax抗體(1∶1000)、抗Bcl-2抗體(1∶1000)、抗Caspase-3(1∶800)4℃孵育過夜。PBS-Tween20液漂洗，HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)，再次用PBS-Tween20液洗膜，ECL顯色，凝膠成像儀中曝光和拍照，檢測(cè)腦組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)情況?；叶戎涤肐mage Pro Plus 6.0軟件來測(cè)定。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Shapro-Wilk檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，采用Bartlett檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同麻醉大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較:兩組大鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)行為評(píng)分均明顯增高，與麻醉A組比較，麻醉B組大鼠在術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h等同時(shí)點(diǎn)時(shí)神經(jīng)行為評(píng)分明顯較低(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖1。

圖1 不同麻醉大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

表1 不同麻醉大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

2.2不同麻醉大鼠術(shù)后腦組織含水量比較:兩組大鼠術(shù)后出現(xiàn)不同程度腦水腫，麻醉B組大鼠在術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h時(shí)與同時(shí)點(diǎn)麻醉A組比較，腦組織含水量均明顯較低(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖2。

表2 不同麻醉大鼠術(shù)后腦組織含水量比較

圖2 不同麻醉大鼠術(shù)后腦組織含水量比較

2.3不同麻醉大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)比較:兩組大鼠術(shù)后腦組織樣本均可見TUNEL陽性表達(dá)細(xì)胞，陽性表達(dá)主要集中于神經(jīng)元胞核，呈點(diǎn)狀或團(tuán)狀深棕色顆粒。兩組大鼠術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且麻醉A組大鼠術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯高于同時(shí)點(diǎn)麻醉B組大鼠(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 不同麻醉大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)比較(×40)

2.4不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白陽性表達(dá)情況比較:免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同麻醉方式干預(yù)后，隨著時(shí)間點(diǎn)的延長，Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均明顯升高，與麻醉A組比較，同時(shí)點(diǎn)麻醉B組在腦出血術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h各時(shí)點(diǎn)Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯較低(P<0.05)，且麻醉B組在術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h各時(shí)點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)水平則明顯高于同時(shí)點(diǎn)麻醉A組(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白陽性表達(dá)情況比較(×40)

2.5不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況比較:麻醉干預(yù)后即刻，麻醉A組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白mRNA表達(dá)水平明顯高于麻醉B組(P<0.05)，麻醉A組大鼠腦組織中凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA表達(dá)水平則明顯低于麻醉B組水平(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

2.6不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較:麻醉干預(yù)后與麻醉B組比較，麻醉A組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白表達(dá)水平明顯較高(P<0.05)，其腦組織樣本中凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)水平則明顯低于麻醉B組水平(P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

3 討 論

靜脈吸入復(fù)合麻醉是指患者同時(shí)或先后實(shí)施靜脈全身麻醉和靜脈吸入麻醉的一種麻醉方式，具有麻醉起效快、術(shù)中易控制、麻醉維持穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但在術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)、認(rèn)知功能障礙、術(shù)后不良反應(yīng)方面具有一定的局限性[6,7]。靶控靜脈麻醉是一種通過調(diào)節(jié)目標(biāo)藥物濃度控制麻醉深度的麻醉方式，具有麻醉深度易于控制、術(shù)后認(rèn)知功能影響小、術(shù)后不良反應(yīng)少、患者應(yīng)激反應(yīng)小等明顯優(yōu)勢(shì)[8,9]。既往腦出血相關(guān)麻醉方式及藥物研究主要在大體標(biāo)本水平進(jìn)行療效評(píng)估，在分子及基因水平方面研究鮮有報(bào)道。由此本研究提出科學(xué)問題：不同麻醉方式對(duì)腦出血病灶區(qū)細(xì)胞凋亡情況是否具有影響。

自發(fā)性高血壓大鼠是目前國內(nèi)公認(rèn)的最接近人類高血壓的動(dòng)物模型[10]。本研究選取自發(fā)性高血壓大鼠作為動(dòng)物模型，為控制腦出血病灶的部位和出血量大小，采用腦組織內(nèi)直接注入自體血的方法構(gòu)建腦出血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｔ摲椒ㄊ亲畛Ｓ玫哪X出血?jiǎng)游锬Ｐ蜆?gòu)建法，形成的血腫形態(tài)大小較穩(wěn)定，同時(shí)還可模擬血液成份對(duì)自身腦組織的損傷作用，適用于研究腦出血后腦水腫改變及機(jī)體神經(jīng)功能改變情況。根據(jù)麻醉方式不同，實(shí)驗(yàn)大鼠分為采用靜脈吸入復(fù)合麻醉的麻醉A組和采用丙泊酚復(fù)合舒芬太尼靶控靜脈麻醉的麻醉B組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦出血模型大鼠在麻醉后6h即開始出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為學(xué)改變及腦水腫改變，且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長，模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加，腦組織含水量也明顯增加，與麻醉A組比較，麻醉B組大鼠在術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及缺血區(qū)腦組織含水量均明顯較低(P<0.05)，提示靶控靜脈麻醉能在一定程度上減少腦出血大鼠腦組織含水量，并減輕神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與麻醉A組大鼠比較，麻醉B組在各時(shí)點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯較低(P<0.05)，麻醉B組大鼠腦出血病灶區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)水平均明顯低于同時(shí)點(diǎn)麻醉A中組(P<0.05)，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平則明顯高于同時(shí)點(diǎn)麻醉A中組(P<0.05)，說明靶控靜脈麻醉可減少腦出血后神經(jīng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，猜測(cè)與舒芬太尼半衰期短、血腦屏障分散快、清除率高等因素有關(guān)，提示在麻醉過程中始終處于動(dòng)態(tài)管理狀態(tài)的靶控靜脈麻醉能更好的為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供補(bǔ)償，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡及損傷。

綜上所述，丙泊酚復(fù)合舒芬太尼靶控靜脈麻醉有效控制麻醉深度及藥物作用濃度，減少腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕腦出血及腦組織水腫程度，改善神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，對(duì)于保障手術(shù)患者的神經(jīng)功能具有積極意義。