楊威，馮艷飛，任國(guó)鑫，高樹仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶163319）

玉米（Zea mays L.）是世界上重要的糧食作物，北方春玉米區(qū)是我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)之一，占我國(guó)玉米播種面積的30%左右。而在這些地區(qū)春季低溫冷害經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重限制玉米種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至可能會(huì)導(dǎo)致玉米生長(zhǎng)后期籽粒品質(zhì)及產(chǎn)量下降[1-3]。因此，篩選并鑒定耐低溫玉米種質(zhì)資源，為培育耐低溫玉米品種就顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)影響玉米等植物細(xì)胞的酶活性、膜系統(tǒng)以及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)[4]。游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)滲透壓大小來降低低溫脅迫對(duì)細(xì)胞酶蛋白質(zhì)和生物膜的傷害[3-5]。楊德光等[5]通過低溫脅迫對(duì)玉米發(fā)芽及幼苗各項(xiàng)生理特性的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下玉米幼苗的MDA含量、POD活性、SOD活性變化趨勢(shì)均為先升后降，低溫脅迫初期上升較快，恢復(fù)初期下降較快，即使恢復(fù)生長(zhǎng)后，各指標(biāo)均高于常溫處理。于海瑞等[6]利用單一變量法分析玉米幼苗低溫脅迫后生長(zhǎng)發(fā)育和生理變化發(fā)現(xiàn)，MDA含量和SOD活性均在低溫脅迫12 h后達(dá)到峰值，POD活性36 h達(dá)到峰值。彭云玲等[7]對(duì)44份玉米自交系進(jìn)行低溫脅迫性狀鑒定，使用隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐寒性綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明低溫處理后，POD和SOD活性有相似的變化趨勢(shì)，而且隨著低溫時(shí)間加長(zhǎng)，下降幅度逐漸增大，由于材料不同，少則下降5.29%，多則下降74.95%。根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，通過分析不同品種的保護(hù)酶活性和丙二醛含量下降或上升幅度大小可以為篩選耐寒種質(zhì)提供理論參考。

因此，試驗(yàn)以前期萌芽期低溫脅迫實(shí)驗(yàn)獲得的4份玉米種質(zhì)資源為研究對(duì)象，三葉一心期進(jìn)行低溫脅迫，通過觀察植株表型和測(cè)定葉片生理生化指標(biāo)來進(jìn)一步鑒定其對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，為玉米耐低溫種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4份玉米自交系，其中C71、東91和京33為萌芽期低溫不敏感型，東46為萌芽期低溫敏感型，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)玉米育種研究室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇玉米種粒均勻飽滿一致的自交系種子，置于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，萌發(fā)后在每個(gè)自交系中挑選出長(zhǎng)勢(shì)一致并且生長(zhǎng)旺盛的種子播種于土壤中，每盆播種5株，每個(gè)材料播種8盆，待生長(zhǎng)至三葉一心期，每個(gè)材料各取4盆分別置于24℃和6℃的培養(yǎng)箱中，24℃處理為對(duì)照組，48 h后取出，稱量鮮重，并保存于冰盒內(nèi)，測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定方法

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定采用紫光分光光度法[8]、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定和過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用于晶[9]的方法、丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用楊德光[5]的方法、游離脯氨酸采用磺基水楊酸法測(cè)定[10-11]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[12]，采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)圖表用Excel 2010制作，使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株表型及葉片含水量變化分析

從圖1A可以看出，在6℃處理48 h后，4個(gè)自交系材料葉片均出現(xiàn)萎蔫、下卷現(xiàn)象，其中東91較其它供試材料植株長(zhǎng)勢(shì)整齊，其余材料均出現(xiàn)少量植株傾斜；圖1B顯示，低溫脅迫后C71、京33、東46與對(duì)照相比鮮重顯著下降，而東91鮮重有下降但不顯著，4個(gè)材料鮮重下降幅度分別為28.3%、16%、19.2%、9.1%。以上結(jié)果說明，低溫脅迫后自交系東91耐低溫能力可能要比其他材料表現(xiàn)好，能夠很好適應(yīng)環(huán)境變化。

圖1 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片表型及鮮重分析Fig.1 The leaf phenotype and fresh weight analysis of different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2 玉米苗期葉片膜質(zhì)化程度分析

2.2.1 丙二醛（MDA）含量

從圖2可以看出，6℃低溫脅迫48 h后，自交系C71、京33、東91的丙二醛含量均顯著上升，上升幅度分別為400%、200%、600%，而自交系東46與對(duì)照相比下降但不顯著，下降幅度為20%。以上結(jié)果說明，東91和京33經(jīng)低溫脅迫后葉片組織過氧化程度較重。

圖2 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片丙二醛（MDA）含量分析Fig.2 The content analysis of MDA in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2.2 電導(dǎo)率分析

從圖3可以看出，6℃處理48 h后，4個(gè)供試材料的電導(dǎo)率和對(duì)照相比變化均顯著，其中自交系C71、東46與東91的葉片電導(dǎo)率均顯著提高，分別增加16.1%、29.8%和34.3%，而京33電導(dǎo)率顯著降低，降低幅度為20.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，低溫脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜透性受到破壞，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，其中C71電導(dǎo)率增加最小，分析其耐低溫脅迫能力可能最好，京33的電導(dǎo)率較對(duì)照降低可能由實(shí)驗(yàn)誤差引起。

圖3 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片電導(dǎo)率分析Fig.3 The analysis of conductivity in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3 玉米苗期葉片保護(hù)酶活性分析

2.3.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

從圖4可以看出，在6℃處理48 h后，4個(gè)玉米自交系品種的PAL活性與對(duì)照相比變化差異均顯著，其中C71、京33、東46顯著下降，分別下降了56.3%、21.2%和41%，而東91顯著上升，上升61.2%。以上結(jié)果說明，自交系東91低溫脅迫后，植株葉片PAL活性比較高，PAL能夠提高植株的抗逆性，所以東91可能更能夠適應(yīng)低溫環(huán)境。

圖4 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性分析Fig.4 The activity analysis of PAL in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

從圖5可以看出，在6℃處理48 h后，4個(gè)玉米自交系品種的SOD活性與對(duì)照相比變化均顯著上升。自交系C71、京33、東46、東91的SOD活性分別上升31.5%、42.5%、96.6%、27.4%。以上結(jié)果說明，東46低溫脅迫后，植株葉片SOD活性上升幅度最大，分析其可能對(duì)低溫響應(yīng)最敏感。

圖5 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性比較Fig.5 The activity analysis of SOD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.3 過氧化物酶（POD）活性

從圖6可以看出，6℃處理48 h后，4個(gè)玉米自交系品種的POD活性與對(duì)照相比變化均顯著，其中京33、東46和東91顯著上升，上升幅度分別為184.6%、85.7%、59.1%，而C71顯著下降，下降幅度為45.8%。以上結(jié)果說明，自交系京33經(jīng)低溫脅迫后POD活性提高最顯著，僅從指標(biāo)考慮分析其耐低溫能力可能較其他自交系表現(xiàn)好。

圖6 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片過氧化物酶（POD）活性分析Fig.6 The activity analysis of POD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4 玉米苗期葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量分析

2.4.1 脯氨酸含量

從圖7可以看出，6℃低溫脅迫48 h后，和對(duì)照相比自交系C71、京33和東91葉片脯氨酸含量均有所增加，分別提高112.4%、76.2%和105.6%，且差異顯著，而自交系東46的脯氨酸含量降低6.4%，但差異不顯著。該結(jié)果說明，自交系C71經(jīng)低溫脅迫后脯氨酸含量增加顯著，其耐低溫能力可能較好，其次為東91。

圖7 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片游離脯氨酸含量分析Fig.7 The content analysis of proline in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.2 可溶性糖含量

由圖8可知，和對(duì)照相比6℃低溫脅迫48 h后，自交系京33和東91可溶性糖含量均有所增加，分別提高36.0%和9.7%，其中京33差異顯著而東91差異不顯著，而C71與東46可溶性糖含量分別降低54.9%和72.9%，且差異顯著。該結(jié)果說明，根據(jù)可溶性糖含量變化分析，京33和東91耐低溫能力可能要優(yōu)于C71和東46。

圖8 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片可溶性糖含量分析Fig.8 The content analysis of soluble sugar in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.3 可溶性蛋白含量

從圖9可以看出，和對(duì)照相比6℃低溫脅迫48 h后，4個(gè)自交系材料的可溶性蛋白含量均有所提高，C71、京33、東46和東91分別提高56.2%、44.4%、22.9%和43.1%，且差異均顯著，增加量由大到小依次為C71>京33>東91>東46。僅根據(jù)可溶性蛋白含量分析，自交系C71的耐低溫能力可能要好于其他供試材料。

圖9 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片可溶性蛋白含量分析Fig.9 The content analysis of soluble protein in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

3 討論

低溫脅迫對(duì)植物生理生化的響應(yīng)比較復(fù)雜，涉及細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及抗氧化酶活性等變化[15]。

丙二醛（MDA）含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，MDA在植物中的含量多少也可以作為判斷植株抗低溫能力的指標(biāo)之一[16]。黃偉超等[17]研究表明，低溫脅迫下，葉片內(nèi)的丙二醛（MDA）含量會(huì)明顯升高。研究與前人研究結(jié)果基本一致，隨著低溫時(shí)間的加長(zhǎng)，其MDA含量上升，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度逐漸加重，但自交系東46的MDA含量明顯低于其他自交系，分析其可能耐低溫能力強(qiáng)。

通過植物細(xì)胞外滲透液導(dǎo)電性的差異能確定膜透性的大小，推測(cè)膜的受傷程度與對(duì)寒冷抗性強(qiáng)弱。楊猛[18]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)耐冷性弱的自交系相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度較大，說明低溫的傷害往往作用于質(zhì)膜，使質(zhì)膜的選擇透過性發(fā)生改變或喪失，導(dǎo)致溶質(zhì)外滲，因此質(zhì)膜的透性變化可顯示細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的受損程度。有研究[19]認(rèn)為抗寒性越強(qiáng)的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)膜的透性在低溫條件下增加的越小，也就是說耐低溫的品種電導(dǎo)率增加的幅度小，從試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4個(gè)自交系的電導(dǎo)率變化均極為顯著，但京33的增加量較少，說明其耐低溫能力可能較強(qiáng)。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）能夠?qū)⒈奖彼岽呋D(zhuǎn)化為肉桂酸，在農(nóng)業(yè)工業(yè)中，肉桂酸可以作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑和長(zhǎng)效殺菌劑，在植物體內(nèi)抵御外界不良環(huán)境的迫害，所以苯丙氨酸解氨酶的活性增強(qiáng)進(jìn)而可以提高植物的抗逆性[20]。研究與范樹國(guó)等[21]的研究結(jié)果相似，玉米幼苗的PAL活性在低溫條件下增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中，C71、京33、東46品種與對(duì)照比較均呈下降趨勢(shì)，其中自交系東91苯丙氨酸解氨酶活性最高，說明自交系東91的耐低溫性可能較強(qiáng)。

超氧化物歧化酶（SOD）作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠清除植物體內(nèi)的ROS（活性氧），大量的實(shí)驗(yàn)顯示SOD可有效提高植物的抗逆性，對(duì)細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用，同時(shí)抗性品種也可以通過SOD酶活性指標(biāo)輔助選擇[22]。張宇婷等[23]研究表明，在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的SOD活性顯著增強(qiáng)以清除大量的活性氧，維持植物正常生理活動(dòng)。研究與前人的研究結(jié)果相似，在低溫條件下，各玉米自交系苗期葉片超氧化物歧化酶活性與對(duì)照相比均呈上升趨勢(shì)，其中C71超氧化物歧化酶活性最高，說明C71的耐低溫性可能較強(qiáng)。

過氧化物酶（POD）是生物界廣泛存在的、在植物體內(nèi)活性較高的一種保護(hù)酶，是酶保護(hù)系統(tǒng)中缺一不可的重要組成部分，它與植物的氧化作用、呼吸作用和生長(zhǎng)素在體內(nèi)的化學(xué)作用休戚相關(guān)，對(duì)保護(hù)機(jī)體免受活性氧的損害可以起到十分重要的作用[24]。在逆境脅迫下，POD活性升高，清除植物體內(nèi)的活性氧，保護(hù)植物體免受逆境環(huán)境的影響，研究與上述林植芳等[25]的研究結(jié)果相似，在低溫條件下，京33、東46、東91品種與對(duì)照相比過氧化物酶活性均呈上升趨勢(shì)，其中京33過氧化物酶活性上升幅度最大且最高。

在低溫脅迫下SOD活性增加明顯的自交系則POD活性不敏感，甚至降低，例如C71；而低溫促使POD活性較高的自交系SOD的活性表現(xiàn)比較弱或者沒有明顯變化，從而證明了植物抗低溫過程中保護(hù)酶系統(tǒng)的各種酶是相互協(xié)調(diào)配合起作用，而不是僅僅依靠某個(gè)酶的活性變化起到抗低溫的效果。

植物受脅迫后合成親水的脯氨酸和可溶性蛋白來維持植物細(xì)胞膨脹狀態(tài)，因此脯氨酸和可溶性蛋白含量與植物脅迫耐受性密切相關(guān)。郝小琴等對(duì)玉米幼苗低溫脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量逐漸增加[26]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。在低溫條件下，玉米的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)與環(huán)境因素的關(guān)系密切，游離脯氨酸含量增加可以保持生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中6℃低溫處理后C71的游離脯氨酸含量明顯增加，說明其耐低溫性可能較強(qiáng)。

可溶性糖作為光合作用的產(chǎn)物之一，可以合成纖維素組成細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)化組成其他有機(jī)物如核苷酸和核酸，分解產(chǎn)物是其他許多有機(jī)物的合成原料，植物為了適應(yīng)低溫、干旱等逆境條件，會(huì)主動(dòng)積累可溶性糖來降低冰點(diǎn)和滲透勢(shì)。可溶性糖是穩(wěn)定原生質(zhì)體與細(xì)胞膜的重要物質(zhì)[27]，它的增加能夠幫助植物細(xì)胞抵御逆境脅迫，試驗(yàn)中C71的可溶性糖含量顯著下降，說明C71的耐低溫能力可能較弱。自交系C71與東46出現(xiàn)可溶性糖含量降低的原因可能與其耐寒性較弱有關(guān)，這兩種自交系在6℃低溫處理后受到傷害，難以正常生產(chǎn)可溶性糖從而導(dǎo)致其含量降低。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成原生質(zhì)的基礎(chǔ)物質(zhì)，在作物的生長(zhǎng)發(fā)育中，細(xì)胞的增長(zhǎng)分裂與新細(xì)胞的形成必須有蛋白質(zhì)的參與。玉米葉片中的可溶性蛋白能夠幫助其減弱外界環(huán)境脅迫對(duì)玉米的損傷，可溶性蛋白含量增加可以保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并且增加其對(duì)外界環(huán)境脅迫的抗性[29]，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)京33自交系的可溶性蛋白含量增加的最為顯著，所以推測(cè)京33品種的抗寒性可能較強(qiáng)。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果可以得出，自交系東91的鮮重下降幅度最小，PAL活性上升幅度最大，SOD活性和POD活性均呈顯著上升趨勢(shì)，比其他品種具有一定的耐低溫優(yōu)勢(shì)，自交系東91綜合各項(xiàng)指標(biāo)略優(yōu)于自交系京33，自交系京33綜合各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于東46、C71，綜合東46各項(xiàng)指標(biāo)除MDA含量比其他3個(gè)品種低之外，均沒有明顯優(yōu)勢(shì)?；谝陨戏治龅贸龈髌贩N耐低溫性強(qiáng)弱為東91>京33>C71>東46，該結(jié)果與前期萌芽期低溫脅迫鑒定結(jié)果具有一致性。實(shí)驗(yàn)初步證明了玉米苗期葉片在低溫脅迫后保護(hù)酶活性和丙二醛含量會(huì)有所變化，并會(huì)對(duì)不良環(huán)境起到一定的抵抗作用，玉米苗期耐低溫性不是某一種酶或代謝產(chǎn)物決定的，是多個(gè)生理生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)，選育苗期抗低溫玉米品種是一個(gè)復(fù)雜的過程，還需進(jìn)一步探討。