關(guān)淑文 王毅 郝佳波 原曉龍 陸斌 李賢忠

摘?要：?為了揭示竹葉花椒萜類代謝的分子機理及嫁接對其風(fēng)味的影響，該文依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR方法從竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）中克隆得到一個全新的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPPS）基因的全長cDNA序列，命名為ZaGGPPS，并利用NCBI、ProParam、SignalP 4.1 server、DNAMAN和MEGA 7.0軟件對ZaGGPPS基因進行生物信息學(xué)分析，并比較其在嫁接樹和實生樹中的表達(dá)量。結(jié)果表明：ZaGGPPS包含完整的cDNA開放閱讀框（OFR），由1 086 bp組成，編碼361個氨基酸。其蛋白的相對分子量為39 079.14 Da，理論等電點pI為6.38。Blast比對結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)屬于GGPPS家族蛋白，含有2個GGPPS蛋白特有的天冬氨酸富集基序，分別是“DDXXXXD”和“DDXXD”，以及5個特征性功能結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示竹葉花椒與蕓香科植物甜橙（Citrus sinensis）、克里曼丁桔（C. clementina）、柚子（C. maxima）等親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR檢測顯示，ZaGGPPS基因在竹葉花椒中的表達(dá)量從高到低分別為實生樹的葉、嫁接樹的葉、實生樹的莖、嫁接樹的莖。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶是竹葉花椒萜類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，通過嫁接可影響ZaGGPPS基因在葉和莖中的表達(dá)量。該文對竹葉花椒ZaGGPPS基因進行了克隆與分析，為后續(xù)深入研究竹葉花椒香氣形成的分子機理及利用分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 竹葉花椒， 牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶， 克隆， 生物信息學(xué)分析

中圖分類號：?Q943

文獻標(biāo)識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0598-08

Abstract：?In order to reveal the molecular mechanism of terpenoid metabolism in Zanthoxylum armatum and the effect of grafting on its flavor， we designed specific primers based on transcriptome data and cloned a novel full-length cDNA sequence of geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPPS） gene from Z. armatum by RT-PCR， and named ZaGGPPS. We analyzed the ZaGGPPS gene by using NCBI， ProParam， SignalP 4.1 server， DNAMAN and MEGA 7.0 softwares. The expression of ZaGGPPS gene in grafted and seedling trees were compared. The results were as follows： ZaGGPPS contained a complete open reading frame （OFR）， consisting of 1 086 bp， encoding 361 amino acids. The relative molecular weight of the protein was 39 079.14 Da and the theoretical isoelectric point pI was 6.38. Blast comparison results showed that the protein belonged to the GGPPS family and contains two specific aspartic acid enrichment motifs， namely “DDXXXXD” and “DDXXD”， and five characteristic functional domains. Phylogenetic tree results showed that Z. armatum had close relationships with sweet orange （Citrus sinensis）， clementine mandarin （C. clementina） and pomelo （C. maxima）. Fluorescence quantitative PCR showed that the expression level of ZaGGPPS gene in Zanthoxylum armatum ranged from high to low as follows： leaf of seedling tree， leaf of grafted tree， stem of seedling tree and stem of grafted tree. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase was a key enzyme in terpenoid biosynthesis pathway of Z. armatum， and grafting can affect the expression of ZaGGPPS gene in leaves and stems. The cloning and analysis of ZaGGPPS gene of Z. armatum provides theoretical basis for further study on the molecular mechanism of aroma formation of Z. armatum and selection of excellent varieties by molecular biological means.

Key words： Zanthoxylum armatum， geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPPS）， cloning， bioinformatics

蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）植物在世界上約有250種，其中我國有39種，14變種（杜麗君等， 2013）。常見的有竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）、青花椒（Z. schinifolium）和紅花椒（Z. bungeanum）（陳茜等， 2018）。竹葉花椒廣泛分布于貴州、廣西、云南等地，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益，其果實可作為食用調(diào)料、藥材等，而且根系發(fā)達(dá)、耐干旱貧瘠（張云等， 2010; 王景燕等， 2016）。因此，西部經(jīng)濟落后且干旱地區(qū)將栽植竹葉花椒作為解決農(nóng)民勞動就業(yè)和增收致富的重要途徑（舒正悅等， 2018）。

竹葉花椒的揮發(fā)油是其香味物質(zhì)的表征成分，而竹葉花椒的揮發(fā)油中有67.122%是萜類化合物，包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-石竹烯、大根香葉烯等物質(zhì)，因此，萜類化合物是竹葉花椒香氣的重要組分（張云等， 2010）。以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元的萜類化合物是植物代謝產(chǎn)物中數(shù)量最多的一類，其還參與植物的多種生理生化活動，如呼吸作用、光合作用、生長發(fā)育、防御、信號傳導(dǎo)、繁殖等，其中部分萜類化合物具有重要的經(jīng)濟價值和藥用價值 （齊小瓊等， 2016）。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase， GGPPS）在萜類化合物生物合成途徑中起著關(guān)鍵作用（魏攀等， 2016）。植物萜類化合物合成途徑分兩個階段，首先是經(jīng)甲基赤鮮糖醇磷酸途徑（methyl-erythritol-phosph-ate， MEP）和甲羥戊酸途徑（mevalonic acid， MVA）生成二甲烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl diphosphate， DMAPP）和異戊烯基焦磷酸（isopenteny pyrophosphate， IPP），然后GGPPS可催化三個不同的反應(yīng)，分別是GGPPS催化1分子法尼基焦磷酸（famesylpyrophosphate， FPP）和1分子IPP;GGPPS催化1分子牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate， GPP）和2分子IPP;GGPPS催化1分子DMAPP和3分子IPP。三個反應(yīng)最后都生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP） （姚雪倩等， 2017）。GGPP不僅是控制植物代謝中“碳流”方向的類異戊二烯化合物，而且還是眾多化合物的通用前體，可在不同的酶促反應(yīng)下參與生成多萜醇、赤霉素、葉綠素、脫落酸、類胡蘿卜素、輔酶Q、獨腳金內(nèi)酯、多酚、維生素E、維生素K等物質(zhì)，同時研究發(fā)現(xiàn)其還參與催化蛋白的異戊二烯化 （Yamamura et al.， 2014; 李澤鋒等， 2015; 張萌等， 2015; 韓立敏， 2015）。因此，GGPPS在植物萜類化合物的合成中扮演著重要角色。李鋒等（2019）發(fā)現(xiàn)在NtGGPPS1基因上調(diào)的煙草中，二萜類化合物與質(zhì)體色素的含量均有所增加;魏攀等（2016）發(fā)現(xiàn)NtGGPPS1基因被特異性沉默后的普通煙草K326表現(xiàn)出植株矮小、生長緩慢、質(zhì)體色素含量低、花期延遲等特點（魏攀等， 2016）。目前人們已在芥藍(lán)（薛生玲等， 2018）、煙草（魏攀等， 2016）、茶樹（姚雪倩等， 2017）、篦子三尖杉（齊小瓊等， 2016）、艾納香（夏奇峰等， 2016）等多種植物中克隆得到牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因，但尚未見到有關(guān)竹葉花椒ZaGGPPS基因的報道。本研究對竹葉花椒ZaGGPPS基因進行克隆與分析，為后續(xù)深入研究竹葉花椒香氣形成的分子機理及利用分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：于云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園（102°44′42.57″ E， 25°08′50.67″ N）采集竹葉花椒嫁接樹和實生樹嫩梢上的葉和莖，用液氮保存帶回實驗室，放在-80 ℃冰箱中。

試劑和儀器：HiFiDNA聚合酶（北京全式金）;pUMT載體、T4連接酶、感受態(tài)細(xì)胞DH5α訂購于生工生物工程（上海）股份有限公司;RNA提取試劑盒（Qiagen）;質(zhì)粒提取試劑盒（康為世紀(jì)）;Super RT試劑盒（Takara）。PCR儀（Bio-Rad）、實時熒光定量PCR儀（ABI）、離心機（Backman）。

1.2 RNA提取與cDNA合成

將竹葉花椒的實生樹和嫁接樹的葉、莖放到液氮中研磨為粉末后，采用植物RNA提取試劑盒提取竹葉花椒葉和莖總RNA，其操作按照試劑盒說明書進行，RNA質(zhì)量檢測使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳完成，檢測RNA濃度則使用NanoDropTM 2000。選擇較完整，濃度適宜的RNA，根據(jù)制造商的說明，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以1 g總RNA進行cDNA合成，并置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。其余的RNA置于-80 ℃冰箱中。

1.3 ZaGGPPS基因的克隆

采用甜橙（Citrus sinensis， NCBI登錄號： XP_006466719.1）的GGPPS基因為模板，本地BLAST搜索竹葉花椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到竹葉花椒的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因（ZaGGPPS）序列，以該序列為依據(jù)，設(shè)計特異引物（ZaGGPPS1F： 5′-ATGACTTGTGTGAATATCGG-3′; ZaGGPPS1R： 5′-TCAATTCTGCCTATAAGCAA-3′）。用竹葉花椒嫁接樹和實生樹嫩梢的cDNA為模板，ZaGGPPS1F和 ZaGGPPS1R為引物，以HiFiDNA聚合酶進行擴增得到ZaGGPPS全基因片段。經(jīng)過電泳檢測后將目的片段連接到pUMT載體上，經(jīng)PCR檢測，送往生工基因進行測序。

1.4 ZaGGPPS基因蛋白序列分析

使用NCBI上的ORF Finder分析獲得的竹葉花椒牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因（ZaGGPPS）的cDNA序列，得到蛋白氨基酸序列，并用ProParam預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì);用SignalP 4.1 server預(yù)測該蛋白有無信號肽;先通過NCBI對牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的蛋白氨基酸序列進行序列搜索，然后選擇與ZaGGPPS蛋白序列同源性較高的植物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶蛋白序列，再利用DNAMAN將其與竹葉花椒GGPPS蛋白序列進行相似度比對，最后利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

成功合成cDNA第一條鏈后，以TZaGGPPSF （5′-ACGCCAAAACTTAAACGCCG-3′）和TZaGGPPSR （5′-GAGAGTTTCTTCTTTGGTAA-3′）作為特異引物，且以ubiquitins（NCBI登錄號： MK953729）作為內(nèi)參基因，經(jīng)熒光定量PCR檢測竹葉花椒ZaGGPPS基因在嫁接樹莖、嫁接樹葉、實生樹莖和實生樹葉中的具體表達(dá)情況。用SYBR Green （invitrogen）檢測特異引物的PCR產(chǎn)物。25 L反應(yīng)體系的可選參數(shù)如下：2×SYBR綠色主混合物12.5 L，上下游引物（10 m·L-1）0.5 L，模板（cDNA）1 L，ddH2O 10.5 L。使用PCR熱循環(huán)儀（ABI 7300; 應(yīng)用生物系統(tǒng)， Foster City， CA， USA）。PCR反應(yīng)程序：變性程序（95 ℃， 10 min），放大定量程序重復(fù)45次（95 ℃， 15 s; 57 ℃， 10 s; 72 ℃， 15 s; 單次熒光測量），熔化曲線程序（60 ℃至95 ℃， 加熱速度0.1 ℃， 連續(xù)熒光測量），最后冷卻至40 ℃。以延伸因子1-alpha （EF1a）基因作為基因正常表達(dá)的內(nèi)部調(diào)控因子，通過qPCR分析每個樣品的至少兩個獨立的生物學(xué)重復(fù)和每個生物學(xué)重復(fù)的三個技術(shù)重復(fù)，以確保再現(xiàn)性和可靠性。用比較Ct值法計算相對基因表達(dá)量f，其中f=2-△△Ct，△△Ct=（試驗?zāi)繕?biāo)基因組的Ct值-試驗組參考基因的Ct值）-（對照組目標(biāo)基因的Ct值-對照組參考基因的Ct值）。

2?結(jié)果與分析

2.1 RNA提取和ZaGGPPS基因克隆

利用植物總RNA提取試劑盒成功提取竹葉花椒嫁接樹和實生樹嫩梢的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以ZaGGPPS1F和ZaGGPPS1R作為特異引物，成功克隆得到竹葉花椒ZaGGPPS基因（NCBI登錄號： MK953731）。在NCBI ORF Finder軟件上對測序結(jié)果分析顯示，ZaGGPPS基因具有完整的全長1 086 bp的cDNA開放閱讀框（ORF），編碼361個氨基酸 （圖1）。

2.2 竹葉花椒ZaGGPPS基因蛋白序列分析

用在線程序NCBI ORF Finder預(yù)測ZaGGPPS基因的開放閱讀框，ProParam預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示：該蛋白由361個氨基酸殘基組成，其分子量為39 079.14 Da，理論等電點pI為6.38;將ZaGGPPS蛋白序列放在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上進行比對，發(fā)現(xiàn)推斷得到的 361個氨基酸序列與已知功能的甜橙（sweet orange， Citrus sinensis）、克里曼丁桔（clementine mandarin， C. clementina）、柚子（pomelo， C. maxima）和白梨（white pear， Pyrus bretschneideri）的GGPPS蛋白序列相似性較高，結(jié)果為ZaGGPPS蛋白序列與甜橙的CsGGPPS蛋白序列相似性為82.32%，與克里曼丁桔的CcGGPPS蛋白序列相似性為82.04%，與柚子的CmGGPPS蛋白序列相似性為82.04%，與白梨的PbGGPPS蛋白序列相似性為73.53%。對竹葉花椒ZaGGPPS蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，其含有2個GGPPS蛋白特有的保守區(qū)，即天冬氨酸富集基序“DDXXXXD”和“DDXXD”（X為任意氨基酸），并且發(fā)現(xiàn)其含有聚異戊二烯合成酶的5個特征性功能結(jié)構(gòu)域（Ⅰ-Ⅴ） （圖2）。

將推導(dǎo)出來的ZaGGPPS蛋白序列放在NCBI上進行比對后，可得到其他植物的GGPPS蛋白序列，用MEGA 7.0中自帶的Cluster W進行蛋白序列多重比對，用Neighbor-joining算法（自檢舉1 000次），繪制出竹葉花椒GGPPS與其他植物GGPPS的進化樹（圖3）。結(jié)果顯示竹葉花椒ZaGGPPS蛋白與甜橙、克里曼丁桔、柚子的GGPPS蛋白聚為一類（圖2）。

2.3 竹葉花椒ZaGGPPS基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

采集竹葉花椒嫁接樹和實生樹的嫩梢，用液氮保存帶回實驗室，用植物總RNA提取試劑盒提取竹葉花椒嫁接樹莖、嫁接樹葉、實生樹莖和實生樹葉的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用特異引物TZaGGPPSF 和 TZaGGPPSR 檢測在嫁接樹葉、嫁接樹莖、實生樹葉和實生樹莖中ZaGGPPS基因的具體表達(dá)情況（圖4），結(jié)果顯示，ZaGGPPS基因在竹葉花椒實生樹的葉中表達(dá)量最高，其次是嫁接樹的葉，再到實生樹的莖，在嫁接樹的莖中表達(dá)量最低。

3?討論與結(jié)論

研究表明，盡管GGPPS基因是個大家族，且各基因存在明顯分化，如同源基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式等存在差異， 但仍有部分同源基因?qū)祁惔x起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，能顯著影響植物體內(nèi)萜類化合物的合成（王中等， 2018）。蛋白序列多重比對顯示竹葉花椒GGPPS與其他植物GGPPS的相似性較高，該氨基酸序列含有GGPPS共有的5個保守結(jié)構(gòu)域，以及FARM（the first aspartate-rich motif）和SARM（the second aspartate-rich motif）這兩個特異功能域，分別是“DDLPCMD”和“DDILD”，其中FARM和SARM是GGPPS催化Mg2+ 橋與底物分子二磷酸基團結(jié)合的關(guān)鍵活性位點（Song & Poulter， 1994; Hemmi et al.， 2003）。Kai et al.（2010）和Wang et al.（2010）的研究發(fā)現(xiàn)，丹參SmGGPPS基因和榛子CgGGPPS基因在葉中的表達(dá)量均高于莖中的表達(dá)量，而本研究經(jīng)轉(zhuǎn)錄模式分析可看出無論是在嫁接樹還是實生樹中，ZaGGPPS基因在葉的表達(dá)量都比在莖中高，這與前人研究結(jié)果相一致。然而，嫁接過后竹葉花椒的葉和莖相對實生樹來說，ZaGGPPS基因分別下調(diào)，從而推測嫁接可影響竹葉花椒ZaGGPPS基因的表達(dá)。

花椒的主要風(fēng)味是麻味和香味，而其香味物質(zhì)的表征成分是揮發(fā)油，包含了醇類、烯類、醛類、酯類、酮類等揮發(fā)性物質(zhì)，同時揮發(fā)油的成分還是評價花椒品質(zhì)的主要指標(biāo)。竹葉花椒香氣成分中的萜類物質(zhì)以單萜居多，其次是二萜，包括檸檬烯、桉樹腦、萜品醇、水芹烯、蒎烯、月桂烯、檜烯、大根香葉烯、石竹烯等（陳茜等， 2018）。當(dāng)前，關(guān)于牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶在植物香味領(lǐng)域的研究多集中在煙草和茶樹這兩類植物中，如林世峰等（2014）發(fā)現(xiàn)煙葉中類胡蘿卜素、二萜類化合物的含量增加，其香氣量也會相應(yīng)增加;姚雪倩等（2017）發(fā)現(xiàn)鐵觀音CsGGPPS基因在芽葉的相對表達(dá)量總體隨芽葉的成熟度增加而增加，從而很好地解釋了在生產(chǎn)加工上需采摘一定成熟度芽葉的原因;王贊等（2019）通過研究推測茶樹CsGGDPS7 基因與其萜類香氣化合物的合成關(guān)系密切。目前尚未見到有關(guān)GGPPS基因?qū)χ袢~花椒香味影響的相關(guān)研究。本研究對竹葉花椒ZaGGPPS基因進行克隆與分析，為今后深入研究竹葉花椒香氣形成的分子機理、利用基因工程手段調(diào)控竹葉花椒萜類化合物的含量及改善果皮香氣品質(zhì)提供理論依據(jù)。

花椒的香氣成分具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值。在制藥方面，因其香氣成分具有促進藥物透皮吸收的功效，故可將其加入到一些外用制劑中，以促進藥物吸收;在食品方面，花椒香氣成分可作為無毒無害的食品防腐劑，以代替苯甲酸鈉、山梨酸鉀等物質(zhì);在農(nóng)業(yè)方面，花椒香氣成分可有效抑制病蟲害的繁殖，以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用（陳茜等， 2018）。因此，在加強花椒香氣成分基礎(chǔ)研究的同時，也應(yīng)加強其產(chǎn)品的開發(fā)與利用，以促進生態(tài)與經(jīng)濟的和諧發(fā)展。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）