楊少彤 劉宗林 屈申 于磊 詹亞光

摘?要：?該文對水曲柳JAZ蛋白家族的一員FmJAZ1的功能及對其上下游基因影響進行了初步分析。首先，利用無縫克隆的方法構建FmJAZ1-pROK2-GUS 過表達載體，利用三親雜交的方法將載體轉入農(nóng)桿菌;然后，使用農(nóng)桿菌對水曲柳組培苗進行瞬時侵染，得到FmJAZ1過表達的侵染苗;最后，在侵染后36 h使用茉莉酸合成途徑抑制劑（DIECA）對侵染苗進行處理，分別取0、1、3、6、18、21、24 h七個時間點的樣品，通過熒光定量PCR對FmJAZ1、FmJAZ2、GL1、EIN3、MYC2 5個基因的表達進行了分析。結果表明：農(nóng)桿菌瞬時侵染水曲柳幼苗后，F(xiàn)mJAZ1表達顯著升高，為空載侵染的3.2倍，說明FmJAZ1瞬時轉入水曲柳并完成基因表達，侵染有效。經(jīng)過DIECA處理的侵染苗FmJAZ1的相對表達量初期下降并出現(xiàn)明顯波動，18 h后恢復平穩(wěn)，證明它是JA通路的作用基因。同時檢測了4個JA通路相關基因的表達，在1 h時JAZ2、GL1表達下調，其余均有輕微上調，隨后各基因表達均有上調。FmJAZ1瞬時轉化水曲柳后FmJAZ1過表達，說明瞬時侵染有效;DIECA處理后FmJAZ1表達顯著下調說明FmJAZ1的合成受JA調控。在水曲柳中，F(xiàn)mJAZ1抑制轉錄因子GL1、EIN3、MYC2、FmJAZ2的表達，且FmJAZ2的合成也受JA調控。綜上結果表明，JAZs不僅調節(jié)JA通路的關鍵蛋白，還參與其他信號通路的調節(jié)，最終通過體內(nèi)JA的表達與其他相關信號分子的協(xié)同表達來調節(jié)植物的生長發(fā)育及其對應激的反應。

關鍵詞： 水曲柳， FmJAZ1基因， 瞬時侵染， JA通路， 基因表達

中圖分類號：?Q943

文獻標識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0662-09

Abstract：?In this paper， the function of FmJAZ1， a member of the Jasmonates （JAZs）， and the influence of its upstream and downstream genes were preliminarily analyzed. Firstly， the FmJAZ1-pROK2-GUS overexpression vector was constructed by using the method of seamless cloning， and then the vector was transferred into Agrobacterium by triparental hybridization. Then， Agrobacterium was used to conduct instantaneous infection on the tissue culture seedlings of Fraxinus mandshurica， and the infected seedlings with FmJAZ1 overexpression were obtained. Finally， the infected seedlings were treated with jasmonic acid synthetic pathway inhibitor （DIECA） at 36 h after infection. Samples were taken at 0， 1， 3， 6， 18， 21， 24 h， respectively. The expressions of FmJAZ1， FmJAZ2， GL1， EIN3 and MYC2 were analyzed by fluorescence quantitative PCR. After Agrobacterium instantaneously infected the tissue culture seedlings of Fraxinus mandshurica， FmJAZ1 expression increased significantly， which was 3.2 times as much as that of?no-load infection. After treatment with DIECA， the relative expression level of FmJAZ1 fluctuated significantly at the initial， but was stable after 18 h， which proved that FmJAZ1 was acting on JA pathway. The expressions of JAZ2 and GL1 are down-regulated at 1 h， while the others were slightly up-regulated， and later the expressions of all the genes were up-regulated. Overexpression of FmJAZ1 after instantaneous infection of F. mandshurica indicated that transient infection was effective. After DIECA treatment， FmJAZ1 expression was significantly down-regulated， indicating that the synthesis of FmJAZ1 was regulated by JA. In Fraxinus mandshurica， FmJAZ1 inhibited the expression of transcription factors GL1， EIN3， MYC2， and FmJAZ2， and the synthesis of FmJAZ2 was also regulated by JA. JAZs not only regulates the key proteins of JA pathway， but also participates in the regulation of other signaling pathways， and finally regulates the growth and development of plants and their response to stress through the expression of JA in vivo and the synergistic expression of other related signaling molecules.

Key words： Fraxinus mandshurica， FmJAZ1 gene， transient infection， JA pathway， gene expression

茉莉酸類物質（JAs）廣泛存在于植物體中，作為信號分子，不僅可以調節(jié)植物的生長發(fā)育，而且可以介導植物體在生物與非生物脅迫下的防御反應。Jasmonate ZIM-domain（JAZ）蛋白（JAZs）屬于TIFY蛋白家族，是茉莉酸通路重要調節(jié)蛋白，參與多個信號通路，響應茉莉酸（JA）的刺激，釋放與之結合的MYC2轉錄因子，啟動JA應答基因的轉錄。有研究顯示JA介導的JAZ蛋白轉錄水平變化與IAA、GA、ET等多種植物激素信號的調節(jié)相關。由此可見，JAZ蛋白不僅能抑制茉莉酸通路應答，還可以通過與其他調控因子互作影響其他信號通路，進而影響植物體生長與代謝。JAZ蛋白也由此成為植物激素調節(jié)網(wǎng)絡的關鍵樞紐（劉慶霞等，2012;Hou et al.， 2013;Iván et al.， 2013;Pérez & Goossens， 2013;孫程等，2014）。目前在擬南芥、水稻、青蒿等植物中關于JAZ蛋白家族的鑒定及其對相關重要通路的影響的研究已初有成果（吳華，2015;王青，2017;夏菁等，2018）。

水曲柳（Fraxinus mandshuira）為木樨科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）喬木，是材質優(yōu)良的珍貴用材樹種，用途廣泛（劉春浩等，2017;孫爽等，2017）。在人工培育水曲柳過程中發(fā)現(xiàn)，水曲柳易受到水曲柳翅果斑點病、水曲柳梢頭白腐、小地老虎、水曲柳蕪菁等多種病蟲害困擾。因為JA通路對植物體響應脅迫具有重要意義，且其在水曲柳抵抗病蟲害中發(fā)揮的作用及機制又尚未可知，本研究將通過瞬時侵染的方法對水曲柳JAZ蛋白家族中的一個成員（ FmJAZ1）的功能進行初步分析，使用DIECA（茉莉酸合成途徑抑制劑）對侵染苗進行處理并對JA通路相關基因（MYB轉錄因子家族GL1，MYC轉錄因子家族MYC2，乙烯通路轉錄因子EIN3，JAZ家族FmJAZ2）的表達進行分析，從而探討FmJAZ1與JA通路相關基因的關系，以期為水曲柳JAZ蛋白功能鑒定及其與其他通路互作研究奠定基礎，也為水曲柳病蟲害檢測與防治提供更多參考。

1?材料與方法

1.1 水曲柳FmJAZ1-pROK2-GUS過表達載體構建

首先使用BamHI和KpnI對載體進行雙酶切，同時設計一對5′端包含21 bp線性化載體同源序列的引物（表1），使用該引物對FmJAZ1進行PCR，將目的基因與載體溫浴連接，并將連接好的載體熱激轉入T1全式金大腸桿菌感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，進行測序鑒定，得到FmJAZ1-pROK2-GUS過表達載體。

1.2 對水曲柳組培苗進行瞬時侵染

1.2.1 三親雜交轉化農(nóng)桿菌?將含有FmJAZ1-pROK2-GUS、空載的大腸桿菌菌液分別同Helper菌液和LBA4404農(nóng)桿菌菌液在不含抗性的液體LB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h進行雜交，取雜菌在含有Rifampin和Kana抗性的液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h培養(yǎng)進行篩選，對得到的雜菌進行菌液PCR驗證，最終得到分別含有空載和FmJAZ1-pROK2-GUS載體的農(nóng)桿菌。

1.2.2 水曲柳FmJAZ1瞬時侵染?設計對照組和實驗組，其中對照組使用含有空載的農(nóng)桿菌侵染水曲柳組培苗，實驗組使用含有FmJAZ1-pROK2-GUS載體的農(nóng)桿菌侵染水曲柳組培苗，選用OD600值為1.0的農(nóng)桿菌與乙酰丁香酮濃度為120 μmol·L-1的WPM培養(yǎng)基置于搖床上共培養(yǎng)2 h進行侵染（徐威等，2003;Li et al.，2009;Jessica et al.，2014;梁童瑤，2015）。在侵染前將選好的水曲柳組培苗置于質量分數(shù)為25%蔗糖高滲溶液中浸泡10 min，提高組培苗韌性，減少操作過程中組培苗的損耗。將侵染結束的組培苗置于WPM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 FmJAZ1及茉莉酸通路相關調控基因的熒光定量PCR

首先在侵染后36 h使用茉莉酸合成途徑抑制劑（DIECA）對完成瞬時侵染的水曲柳組培苗進行噴施處理，將兩種處理過的侵染苗分別設置0、1、3、6、18、21、24 h 7個時間點進行取樣（取整株10 cm水曲柳組培苗為樣品），每個時間點設置三組平行實驗，每三株為一組，留一組不進行處理。取樣時使用液氮進行冷凍并置于-80 ℃冰箱保存，待所有實驗組取樣完畢后，使用Tris-cTAB法提取樣品RNA，對RNA進行反轉錄，選取水曲柳微管蛋白基因FmTU為內(nèi)參對7個時間點的FmJAZ1、FmJAZ2、GL1、EIN3、MYC2表達進行熒光定量PCR。

1.4 材料

菌種：T1全式金感受態(tài)細胞、LBA4404農(nóng)桿菌、Helper菌。試劑盒和工具酶：南京諾唯贊ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit試劑盒、TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒、BamHI酶、KpnI酶、LaTaq酶?；瘜W試劑及其他：卡那霉素、利福平、瓊脂糖、LB培養(yǎng)基、水曲柳組培苗、DIECA（茉莉酸合成途徑抑制劑）、蔗糖、乙酰丁香酮、WPM培養(yǎng)基、Tris-cTAB、氯仿、無水乙醇、5 mol·L-1氯化鋰、70%乙醇、DEPC水。

2?結果與分析

2.1 三親雜交轉化農(nóng)桿菌

三親雜交后對農(nóng)桿菌進行菌液PCR驗證，對含有pROK2-GUS載體農(nóng)桿菌PCR 得到500～750 bp片段（即載體CDS區(qū)域），基因片段大于500 bp，F(xiàn)mJAZ1-pROK2-GUS農(nóng)桿菌PCR得到片段在1 000～2 000 bp，驗證結果空載和FmJAZ1-pROK2-GUS載體均轉入農(nóng)桿菌。

2.2 水曲柳瞬時侵染誘導過表達

瞬時侵染過程中組培苗不可避免的受到外界刺激，JA含量定會有所升高，以空載侵染作為對照，通過FmJAZ1過表達來驗證瞬時侵染結果。對7個時間點中FmJAZ1的表達量進行2-ΔΔCt處理計算比較 Ct值，得到相對表達量柱狀圖， 如圖4所示，瞬時侵染后36 h（尚未進行DIECA處理，即圖中0 h ）FmJAZ1相對表達量為3.249 01（>1），相對空載侵染表達上調，F(xiàn)mJAZ1基因轉入水曲柳組培苗，說明瞬時侵染有效。

由于DIECA處理抑制了JA的合成，F(xiàn)mJAZ1的表達也受到抑制并出現(xiàn)波動，處理后1 h的FmJAZ1相對表達量為1.071 31，遠低于最初的3.249 01，這說明FmJAZ1過表達受到DIECA抑制，F(xiàn)mJAZ1的合成受JA調控。隨著時間的延長，DIECA抑制作用減弱，JA逐漸積累，處理3 h后相對表達量為3.990 04，較1 h有大幅上升;處理后6 h的FmJAZ1表達量達到峰值6.802 95。隨后18、21、24 h相對表達量回落，此時FmJAZ1表達量仍是空載的1.8、1.9倍，表現(xiàn)出過表達的特征，這一方面說明瞬時侵染有效，另一方面顯示DIECA抑制減弱后FmJAZ1表達水平出現(xiàn)反彈的動態(tài)變化，也驗證了FmJAZ1確實是JA通路的關鍵基因。

對各個時間點JA通路上下游的相關基因—FmJAZ2、GL1、EIN3、MYC2的相對表達量進行分析，得到FmJAZ2、GL1、EIN3、MYC2與FmJAZ1的相對表達量數(shù)據(jù)圖（圖5-8）。DIECA處理1 h FmJAZ1過表達被抑制時，F(xiàn)mJAZ2、GL1表達下調，隨后DIECA抑制作用減弱 FmJAZ1過表達恢復并顯著上調時，其余基因表達均顯示上調。

3?討論與結論

JAZ蛋白是JA通路的抑制因子，F(xiàn)-box蛋白COI1可以感知生物活性JAs，然后通過泛素-蛋白酶體途徑降解JAZs，進而激活參與植物生長、發(fā)育和防御的基因表達（圖9）。當缺乏JA作為激活信號時，JA通路下游各轉錄因子（MYC2、GL1、EIN3）受JAZs 蛋白抑制下游調控開關關閉;當JA作為激活信號存在時，COI1、JA-Ile以及JAZ蛋白組成共受體復合物，COI1通過26S蛋白酶調控泛素依賴的JAZ蛋白降解進而釋放抑制狀態(tài)下的轉錄因子， 其中COI1是F-box蛋白并且在SCFCOII泛素連接酶復合體中作為底物特異性受體存在（圖9）（吳德偉等，2018;李罡等，2019）。對侵染后36 h的水曲柳組培苗使用DIECA進行處理，圖4中處理后FmJAZ1的表達出現(xiàn)了一個短暫的波動，其中1 h 的FmJAZ1表達量較未處理時上調不明顯，此時DIECA（茉莉酸合成途徑抑制劑）處理抑制JA合成，F(xiàn)mJAZ1的響應隨之受到抑制，因此，在水曲柳中FmJAZ1合成受到JA的調控，是JA通路下游轉錄因子。

有研究表明，JA的合成會受到JA和其合成過程的中間產(chǎn)物的正向反饋調節(jié)，且已知JA 合成的正向反饋回路為SCFCOI1-JAZ調控模式，可以激活JA 合成途徑中相關酶LOX、AOC、AOS和OPR3的表達;其合成也受負調節(jié)因子JAZ的蛋白酶體降解途徑的調控，同時受MYC2的正調控，從而使植物體內(nèi)JA含量及其合成相關基因的表達處于一個穩(wěn)定的水平（陳碧思，2017），因此，處理后3～6 h植物體內(nèi)JA含量會逐漸升高， FmJAZ1相對表達量有顯著上調，此時的FmJAZ1一方面響應JA信號恢復過表達，另一方面過表達抑制JA下游轉錄因子的表達。

MYB轉錄因子通過與JAZs互作調節(jié)茉莉酸通路，在擬南芥中JAZ蛋白能夠作用于WD-repeat/b HLH/MYB復合體的b HLH （GL3、EGL3和TT8） 和MYB （MYB75、GL1） 抑制復合體的活性，JA通過誘導JAZ蛋白降解， 解除JAZ蛋白對WD-repeat/b HLH/MYB復合體的抑制作用， 從而促進色素苷的積累和表皮毛的產(chǎn)生， 增強植物對病蟲害和紫外等非生物脅迫的抗性（圖9）（吳德偉等，2018）。未處理時FmJAZ1過表達而GL1表達下調可以證明FmJAZ1對GL1表達具有抑制作用（圖5）。因此3 h時JA積累，誘導FmJAZ1降解，其對GL1抑制大大解除，GL1過表達。但是在1 h時，JA含量減少，F(xiàn)mJAZ1表達減弱，GL1沒有顯示出上調趨勢。由于MYB轉錄因子過表達會增加JA的合成（陳碧思，2017），由數(shù)據(jù)可得，體內(nèi)JA含量大幅降低，GL1保持下調;GL1過表達，JA合成增加，推測JA與GL1存在互相調控。

目前對與JAZs各成員具體功能研究較少，現(xiàn)有研究顯示大部分JAZs蛋白質都能夠與其自身或其他蛋白質存在相互作用形成同源或異源二聚體參與信號轉導，并且JAZs之間可能存在著功能冗余現(xiàn)象（閆會轉，2014）。如圖6中所示，未處理時FmJAZ1過表達，F(xiàn)mJAZ2表達下調，說明FmJAZ1可以抑制FmJAZ2表達。1 h FmJAZ1表達受抑制，F(xiàn)mJAZ2依然表達下調，說明FmJAZ2同F(xiàn)mJAZ1一樣，表達受JA調控。在FmJAZ1表達平穩(wěn)時FmJAZ2再次出現(xiàn)顯著上調，加上處理后FmJAZ2變化趨勢與其他轉錄因子相似，由此推測水曲柳中FmJAZ2與FmJAZ1不同，它的主要功能不在于調控JA通路下游基因，可能存在對植物體正常生長發(fā)育的調控。

MYC2轉錄因子在JA與其他激素及轉錄因子互作調控的多種發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用， MYC2轉錄因子是MYC/bHLH家族中的重要成員， 是JA信號途徑中最重要的轉錄因子，它可以正向或負向調節(jié)多種茉莉酸介導的響應，并且與大多數(shù)的 JAZs 都互作（孫程等，2014;閆會轉，2014），其不僅是大量JA信號通路分支的核心調控因子， 還可以調控植物組織和器官的生長發(fā)育（李罡等，2019）。同樣都是JA下游轉錄因子，MYC2和GL1不同處理后并沒有下調，甚至有輕微上調，一方面是由于MYC2可以誘導JA合成，另一方面是植物體正常情況下存在與JAZs競爭性結合MYC2的因子，使MYC2表達從而介導JA信號，維持植物體生長和防御之間的平衡（閆會轉，2014）。從圖7可看出，MYC2上調程度隨FmJAZ1變化而變化，可見在水曲柳中MYC2是JA通路主要調控的轉錄因子，主要受JAZs調控。FmJAZ1雖是MYC2抑制因子，在FmJAZ1過表達時MYC2表現(xiàn)出上調;FmJAZ1上調程度下降時，MYC2也隨之變化，可見二者之間存在由JA介導的反饋機制，即當FmJAZ1過表達時，MYC2過表達促進JA合成，進而降解FmJAZ1，但是JA合成又會誘導FmJAZ1表達，F(xiàn)mJAZ1和MYC2由此通過JA互相鉗制，導致其隨彼此變化而變化。

乙烯是重要的植物激素，茉莉酸和乙烯具有協(xié)同和依賴作用。EIN3轉錄因子負責促進乙烯傳感下游基因轉錄。當JAZs結合EIN3時會部分抑制其活性;當有JA存在時，JAZs被降解，使得EIN3全部激活這樣乙烯轉錄因子EIN3通過與 JAZs 的聯(lián)系使得乙烯調控分級進行（孫程等，2014）。如圖8所示，處理后1 h FmJAZ1對EIN3抑制作用持續(xù)存在，隨著JA含量恢復，F(xiàn)mJAZ1對EIN3抑制作用隨之解除EIN3過表達。但是同為轉錄因子，為何EIN3的上調程度遠不及MYC2和GL1？推測原因可能是在水曲柳中也存在MYC2抑制EIN3表達的機制，MYC2幾十倍的上調表達影響了JA對EIN3的誘導。

綜上所述，我們對FmJAZ1功能結合其與上下游基因關系進行了初步分析，并對相關基因與JA通路關系進行合理推測。在水曲柳中FmJAZ1表達與否取決于植物體內(nèi)JA含量，數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)mJAZ1不僅具有對JA通路重要轉錄因子基因MYC2的抑制功能，并且對MYB轉錄因子家族成員基因GL1、乙烯通路轉錄因子基因EIN3同樣具有抑制功能，區(qū)別在于，MYC2、GL1轉錄因子雖然受FmJAZ1抑制，但在一定條件下它可以調控FmJAZ1的降解。FmJAZ2也受FmJAZ1的抑制且其表達也由JA決定，但其功能不詳，應當與FmJAZ1不同。

通過對FmJAZ1以及對JA通路相關基因的分析可以看出，在水曲柳中，JAZs不僅調控JA通路的關鍵蛋白，也參與調控其他其他信號通路，并最終通過體內(nèi)JA表達及其它相關信號分子的協(xié)同表達來調節(jié)其生長發(fā)育和對脅迫的響應，水曲柳中相關信號分子的研究和互作機制的揭示將對水曲柳人工栽培，水曲柳抵抗病蟲害能力的增強具有重要意義。

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（責任編輯?李?莉）