畢艷 鄭偉 周濤 江維克 楊昌貴 肖承鴻 周太敏

摘?要：?GSTs （glutathione-S-transferases）是一個普遍存在于植物體內(nèi)，多基因家族編碼的多功能蛋白酶。為研究GSTs基因家族在太子參中對其生長發(fā)育以及活性成分合成調(diào)控的潛在功能，該文基于隱馬爾可夫模型在太子參中鑒定到30個谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（PhGSTs）的基因家族成員。結(jié)果表明：30個PhGSTs基因同時具有高度保守的N-端結(jié)構(gòu)域和復雜多變的C-端結(jié)構(gòu)域，分屬于6個亞家族，有10個motif區(qū)，其中motif 1、motif 2、motif 3同屬于所有家族，motif 4僅屬于Tua亞家族。PhGST蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)有明顯的相似之處，N端主要由3個α螺旋和4個β折疊構(gòu)成βαβαββα結(jié)構(gòu)域，C端均由α螺旋構(gòu)成，不同亞家族的C端α螺旋數(shù)目及組合方式各不相同，但始終維持相似的三維結(jié)構(gòu)。PhGST基因在太子參植物中具有不同的組織表達特異性，PhGSTU1、PhGSTU8、PhGSTU9等在太子參塊根中優(yōu)勢表達，PhGSTF2在莖和葉中優(yōu)勢表達。水分脅迫處理后有4個基因積極響應干旱脅迫，PhGSTZ1的響應最為明顯;同時也有PhGSTU8、PhEFB1γ3等4個基因隨土壤含水量增加呈上調(diào)表達。該文鑒定出30個PhGST基因，并分析了其在太子參中的表達模式，為PhGSTs基因家族在太子參活性成分的合成調(diào)控及逆境響應等生理過程中的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 太子參， GSTs， 基因家族， 生物信息學分析， 表達分析

中圖分類號：?Q941

文獻標識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0535-11

Abstract：?GSTs （glutathione-S-transferases） is a multi-functional protease commonly existing in plants and encoded by multi-gene family. In order to study the potential function of GSTs gene family in regulating the growth and development of Pseudostellaria heterophylla and the synthesis of active components， 30 glutathione-S-transferase （PhGSTs） gene family members were identified in P. heterophylla based on hidden Markov model. The results were as follows： 30 PhGSTs genes had both highly conserved N-terminal domain and complex and changeable C-terminal domain， which belonged to six subfamilies and ten motif regions， among which motif 1， motif 2 and motif 3 belonged to all families， motif 4 belonged only to Tua subfamily. There were obvious similarities in the tertiary structure of PhGST protein. The N-terminal mainly consisted of three α helices and four β folds to form βαβαββα domain. The C-terminal consisted of α helices. The number and combination of C-terminal α helices of different subfamilies were different， but the similar three-dimensional structure was always maintained. PhGST gene had different tissue expression specificities in P. heterophylla plants. For example， PhGSTU1， PhGSTU8， PhGSTU9 and other genes were preferentially expressed in the root tuber of P. heterophylla， and PhGSTF2 was preferentially expressed in stems and leaves. Four genes responded positively to drought stress after water stress treatment， and PhGSTZ1 showed the most obvious response. At the same time， four genes were up-regulated with the increase of soil water content， such as PhGSTU8 and PhEFB1γ3. In this paper， 30 PhGST genes were identified and their expression patterns in P. heterophylla were analyzed， which laid a theoretical foundation for the functional research of PhGSTs gene family in physiological processes such as synthesis regulation of active components in P. heterophylla and stress response.

Key words： Pseudostellaria heterophylla， GSTs， gene family， bioinformatics analysis， expression analysis

中藥太子參來源于石竹科植物孩兒參（Pseudostellaria heterophylla）的干燥塊根，有效物質(zhì)基礎(chǔ)包含多糖、皂苷和環(huán)肽類物質(zhì)。前人研究發(fā)現(xiàn)，在太子參的種植中，植株生長代謝受到遺傳及環(huán)境等因素的影響，次生代謝成分在太子參的不同組織部位含量具有顯著差異，并且這些活性成分含量與年均降水量具有密切聯(lián)系（曾麗娜等，2014;康傳志等，2016;邊麗華等，2018）。已有研究認為，谷胱甘

肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase genes，GSTs，EC2.5.1.18）在植物中具有逆境響應、參與次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控等作用（Dixon?et al.， 2010）。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是一種普遍存在于生物體內(nèi)，具有不同生物學功能的基因家族。在高等植物中，被分為Phi（GSTF）、Tau（GSTU）、Lambda（GSTL）、Theta（GSTT）、Zeta（GSTZ），dehydroascorbate reductase（DHAR）、elongation factor 1 gamma（EF1Bγ）及tetrachlorohydroquinone dehalogenase（TCHQD）八個亞家族（Mohsenzadeh et al.， 2011）。典型的GST蛋白包含兩個活性位點：一個是高度保守的N端結(jié)構(gòu)域的GSH結(jié)合位點（G-site）;另一個是復雜多變的C端共底物結(jié)合域（H-site）。G-位點對谷胱甘肽（glutathione，GSH）有特異性，而H-位點能特異性結(jié)合不同底物而催化相應的生化反應（Dixon et al.， 2002）。自20世紀70年代在玉米中首次發(fā)現(xiàn)植物谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶以來（Shimabukuro et al.， 1970），許多植物中的GST也都相繼被挖掘。目前，已通過轉(zhuǎn)錄組或全基因組分析從擬南芥（Jing et al.， 2018）、水稻（Hu et al.， 2011）、毛果楊（Qi et al.， 2019）、鵝掌楸（成彥麗等，2018）、火把梨（劉迪秋等，2012）等植物中鑒定到超過58個GST基因家族成員。然而關(guān)于GST基因家族在太子參中對其生長發(fā)育以及活性成分合成調(diào)控的潛在功能研究尚未見報道。

本文對太子參的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行挖掘與分析，全面篩選出太子參GST候選基因，系統(tǒng)分析太子參GST基因家族的基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域信息、進化關(guān)系及表達模式等，以期為GST基因家族在太子參環(huán)肽、多糖及皂苷等活性成分的合成調(diào)控以及逆境響應的研究奠定生物信息學基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1 構(gòu)建太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫

課題組前期通過Illumina測序平臺對太子參根、莖、葉、花等組織的RNA進行測序，并將其組裝成有127 334個太子參高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Jun et al.， 2016），命名為DB1。2018年4月下旬，于貴州省黃平縣太子參種植基地采集太子參苗，單株移栽至花盆中。土壤配方為：V（基地自然土壤）∶V（營養(yǎng)土）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）=3∶3∶1∶1，花盆外徑23.5 cm，移栽后正常澆水，待太子參長至塊根快速膨大期（6—7月）開始處理。選擇長勢一致的太子參種苗33株，分為30%（drought stress，DS）和100%（waterlogging stress，WS）的土壤水分2個處理組和60%土壤水分（Control）的對照組，又將30% 和100% 處理組各分為5個小組，每組3株，處理時間分別為1～15 d、16～30 d、31～45 d、46～60 d、1～60 d。處理60 d后單株采挖太子參，分離地上與地下部分，以流水將塊根洗凈后，置液氮中速凍5 min，-80 ℃保存用于轉(zhuǎn)錄組測序。利用Illumina二代測序技術(shù)對不同水分脅迫處理后的太子參塊根進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得1個含有258 427個轉(zhuǎn)錄本的太子參水分脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，命名為DB2。

1.2 PhGST基因的篩選及基本信息分析

運用PFAM（http：//pfam.xfam.org）在線軟件，以GST為關(guān)鍵詞進行檢索，下載GST結(jié)構(gòu)域蛋白序列，用該結(jié)構(gòu)域HMM文件，使用HMMER3.0軟件（http：//hmmer.janelia.org/）對DB1數(shù)據(jù)庫中注釋基因序列進行GST基因的比對搜索，篩選出具備GST保守域的GST基因序列;通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）軟件對候選GST基因進行ORF預測分析，篩選出具有完整的ORF區(qū)的太子參GST基因;用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）軟件對篩選出的候選基因是否具有GST保守結(jié)構(gòu)域進一步確認。

運用ExPASy-ProtParam tool在線分析工具（http：//web.expasy.org/protparam/）對所得GST基因編碼蛋白的氨基酸殘基長度（aa）、分子量（Da）、等電點（pI）等基本性質(zhì)進行分析。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和保守基序分析

運用MEGA7.0（molecular evolutionary genetics analysis program）對鑒定出的太子參GST蛋白序列進行比對分析，使用鄰接法（neighbour-joining method，NJ）（其中Bootstrap分析進行了1 000次重復）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）對太子參GST基因的保守基序進行分析，保守基序數(shù)目設(shè)置為10，其他參數(shù)設(shè)置為默認值。

1.4 PhGST蛋白保守域序列分析

運用DNAMAN 5.0和WebLogo 3軟件分析PhGST蛋白的保守序列;利用SWISS-MODEL對PhGST蛋白保守域的3D結(jié)構(gòu)進行模型匹配，swiss-pdbviewer 4.10軟件將3D結(jié)構(gòu)可視化。

1.5 PhGST基因在不同組織中的表達模式分析

提取DB1數(shù)據(jù)庫中PhGST基因序列在根、莖、葉、花等不同組織中的FPKM值，運用TBtools軟件進行聚類分析，所有數(shù)據(jù)均通過log變換進行調(diào)整，選擇層次聚類分析作為計算方法，完全連鎖作為聚類方法。

1.6 不同水分脅迫下PhGST基因在根中表達模式分析

通過本地BLAST在DB2數(shù)據(jù)庫中比對在DB1數(shù)據(jù)庫中檢索到的PhGST基因序列，選擇相似度為100%的轉(zhuǎn)錄本，提取PhGST基因序列在不同水分脅迫處理下的FPKM值，利用TBtools軟件進行聚類分析，所有數(shù)據(jù)均通過log變換進行調(diào)整，選擇層次聚類分析作為計算方法，完全連鎖作為聚類方法。

1.7 不同水分脅迫下太子參次生代謝產(chǎn)物的積累

參考閆亮等（2005）、康傳志等（2016）的方法，分別測定粗多糖、總皂苷、太子參環(huán)肽HB的含量。

1.8 PhGSTs基因的表達量與太子參次生代謝產(chǎn)物含量的相關(guān)性分析

利用GraphPad Prism 8對PhGSTs基因的表達量與太子參次生代謝產(chǎn)物含量進行相關(guān)性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 太子參轉(zhuǎn)錄組GST基因的篩選與基本信息分析

以GST為關(guān)鍵詞在PFAM中進行檢索，共下載了6條GST保守域的蛋白序列（PF00043、PF02798、PF13409、PF13410、PF13417、PF14497、PF14834、PF17171、PF17172），使用HMMER3.0軟件對DB1數(shù)據(jù)庫中的注釋基因序列進行GST基因序列比對搜索，得到66條具有GST-N或GST-C結(jié)構(gòu)域的GST基因序列，其中有15條只具有GST-N結(jié)構(gòu)域，有11條只具有GST-C結(jié)構(gòu)域;經(jīng)進一步篩選，獲得40條同時具備GST-N和GST-C結(jié)構(gòu)域的基因序列。最終通過ORF Finder篩選出30條具有完整ORF區(qū)的GST基因序列。太子參GST基因家族30個基因編碼蛋白的氨基酸長度為180～417 aa;除EF1Bγ家族的相對分子質(zhì)量大于40 kDa，其余GST蛋白的相對分子質(zhì)量多在23～33 kDa之間，這和Frova（2010）總結(jié)的GST蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)論類似，即大多數(shù)可溶性GST以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮催化活性，單體大小在20～30 kDa左右;理論等電點pI范圍為4.88～9.11，80%的均在5.30～6.72之間（表1）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和保守域基序motif分析

將太子參30個GST蛋白進行分類并命名，顯示30個PhGST蛋白共聚成了6個亞家族，包括13個Tua類、7個Phi類、4個EF1Bγ類、3個Zeta類、2個Lambda類、1個DHAR類（圖1：A）。利用MEME對30個PhGST基因的motif進行預測，結(jié)果顯示每個亞家族中motif的排列是相似的，但不同亞家族中motif的排列不同（圖1：B）。其中，motif 1、motif 2、motif 3同屬于所有家族，motif 6、motif 7、motif 8、motif 9、motif 10為Phi和EFB1γ家族特有，motif 4為Tua家族特有。進一步比較太子參與甜菜、擬南芥、水稻中GST蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)所有植物的GST蛋白聚為1大支，Tua是4種植物中最大的一個亞家族，占每個植物GST基因總數(shù)的一半以上，Theta和DHAR在所有植物中數(shù)量均較少，在太子參中尚未鑒定出Theta家族的成員，DHAR家族僅鑒定到1個基因（圖2）。

2.3 PhGST蛋白保守域序列分析

圖3結(jié)果表明，PhGST家族存在GST-N、GST-N2、GST-N3、GST-C、GST-C2、GST-C3等多個保守結(jié)構(gòu)域。GST-N結(jié)構(gòu)域高度保守（圖3：A），結(jié)構(gòu)域為GST-N的僅有Tua類，結(jié)構(gòu)域為GST-N2的有EFB1γ和DHAR 2個亞家族，結(jié)構(gòu)域為GST-N3的有Phi、Lambda、Zeta 3個亞家族;C端結(jié)構(gòu)域變異較大（圖3：B），結(jié)構(gòu)域為GST-C的有Tua和Phi兩個亞家族，結(jié)構(gòu)域為GST-C2的有Tua、EF1Bγ、Lambda、DHAR 4個亞家族，結(jié)構(gòu)域為GST-C3的有Phi、EF1Bγ、Zeta 3個亞家族。

預測PhGST蛋白三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，相似之處包括N端與C端2個主要的結(jié)構(gòu)域。N端主要包括3個α螺旋和4個β折疊結(jié)構(gòu)，α螺旋和β折疊的連接順序為βαβαββα，構(gòu)成βαβαββα結(jié)構(gòu)域;隨后通過一個短的多肽連接C端，C端全部為α螺旋。以PhGSTU1、PhGSTF1、PhEF1Bγ1、PhGSTL1、PhDHAR、PhGSTZ1蛋白為例，對其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行分析。其中PhGSTU1與楊柳科植物毛果楊的GST蛋白（PtGSTU30）的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測Ser25、Phe27、Lys52、Lys64、Gln65、Ile66、Glu78和Ser79是PhGSTU1的關(guān)鍵活性G位點;PhGSTF1與PtGSTF5蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測Ser11、Thr12、Asn13、Arg16、Leu35、His40、Lys41、Asn49、Gln53、Val54、Pro55、Glu66、 Ser67和Arg68是PhGSTF1的關(guān)鍵活性G位點;PhEF1Bγ1與乳酸的yghu蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測Ala11、Asn13、Phe35、His40、Lys41、Gln53、Val54、Pro55、Glu66、Ser67和Arg68是PhEF1Bγ1的關(guān)鍵活性G位點;PhGSTL1與PtGSTL1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測Cys36、Pro37、Tyr38、Leu62、Arg65、Asn77、Lys78、Val79、Pro80、Glu91和Ser92是PhGSTL1的關(guān)鍵活性G位點;PhDHAR與PtGSH蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測Lys8、Cys20、Pro21、Phe22、Arg25、Leu44、Lys47、Gly58、Lys59、Val60、Pro61、Asp72、Ser73、Asp74和Lys209是PhDHAR的關(guān)鍵活性G位點;PhGSTZ1與擬南芥ArGSTZ蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似，預測His95、Lys96、Asn153和Cys154是PhGSTZ1的關(guān)鍵活性G位點。

2.4 PhGST基因在不同器官組織中的表達模式分析

基因在植物組織中的特異性表達，決定了其發(fā)揮的功能，對于同一個基因家族的不同成員，往往表現(xiàn)為時間和空間的表達特異性。對PhGST基因在太子參植株根、莖、葉、花中的表達情況進行分析，結(jié)果見圖5：A。結(jié)果顯示，30個PhGST基因在不同器官中均呈現(xiàn)差異表達。PhGSTU1、PhGSTU8、PhGSTU9、PhGSTU11、PhGSTZ1、PhGSTZ2、PhEFB1γ、PhGSTF7等基因在太子參植株中具有相同的表達模式，均在根中有優(yōu)勢表達，在莖、葉、花等器官幾乎不表達;PhGSTF2在莖和葉中呈優(yōu)勢表達;PhGSTF7、PhGSTZ3則呈現(xiàn)綜合表達模式，即根、莖、葉、花等部位均具有較高的表達，猜測這兩個基因可能在器官的生長發(fā)育調(diào)控過程中具有重要作用;也有部分PhGST基因在太子參各組織器官中均不表達，如Phi家族的成員及PhGSTU2、PhGSTU10、PhGSTL2等基因（圖5：A）。

2.5 水分脅迫下PhGST基因在根中表達模式分析

水分是影響太子參藥材品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一，GST基因家族參與植物的逆境響應等生理過

程。對30個PhGST基因在水分脅迫下的表達模式進行分析，結(jié)果顯示，水分脅迫處理后PhGST基因在太子參塊根中的表達模式基本相似，呈組成型上調(diào)或下調(diào)表達，且上調(diào)表達的基因?qū)λ兴置{迫處理都有一定的響應（圖5：B）。結(jié)合PhGST基因在植株各組織中的表達情況分析，發(fā)現(xiàn)PhGSTU1、PhGSTU8、PhGSTU9等基因正常情況下在根中有較高的表達，水分脅迫處理后此類基因仍在根中有表達;其中有部分基因隨土壤含水量的增加呈上調(diào)表達，如PhGSTU8、PhEFB1γ3;有些基因隨土壤含水量的增加呈下調(diào)表達，如PhGSTZ1、PhGSTU9;有部分基因在水分脅迫處理情況后出現(xiàn)表達量極低或幾乎不表達的現(xiàn)象，如PhGSTU5、PhGSTU12、PhEFB1γ2等基因（圖5：C）。

2.6 不同水分脅迫下太子參次生代謝產(chǎn)物的積累

對不同水分脅迫處理后的太子參環(huán)肽HB、總皂苷、粗多糖進行檢測，結(jié)果顯示，以土壤相對含水量60%為對照組，水滯脅迫下太子參環(huán)肽HB顯著高于干旱脅迫組和對照組（圖6：A）;對太子參進行水分脅迫處理后，其總皂苷含量顯著高于對照組（圖6：B），但其粗多糖含量在經(jīng)過水分脅迫處理后的積累量低于對照組（圖6：C）。

2.7 PhGSTs基因的表達量與太子參次生代謝產(chǎn)物含量的相關(guān)性分析

利用GraphPad Prism 8對PhGSTs基因的表達量與太子參次生代謝產(chǎn)物含量進行相關(guān)性分析。水分脅迫下，PhGSTL1及PhEF1Bγ4與環(huán)肽HB的積累量呈顯著正相關(guān)，PhGSTF1與環(huán)肽HB的積累量呈顯著負相關(guān)，PhGSTU1與PhGSTU11總皂苷的積累量呈極顯著負相關(guān)，PhGSTZ3及PhGSTU6與總多糖的積累量呈顯著正相關(guān)。

3?討論與結(jié)論

GSTs是一個龐大且多樣的基因家族，普遍存在于各種生物體內(nèi)。目前，已分別從擬南芥、水稻、甜菜、毛果楊及馬鈴薯等植物中鑒定出多個GST基因，Tau類及Phi類是植物中具有較多成員數(shù)目的兩個亞家族（Han et al.，2018; Ding et al.，2017）。本文從太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定到30個同時具備GST-N和GST-C結(jié)構(gòu)域、具有完整開放閱讀框的GST蛋白酶基因，分屬于6個亞家族，占高等植物GSTs基因家族的75%，表明太子參能夠抵御多種環(huán)境脅迫，其廣泛的生態(tài)適應性與豐富的GSTs基因家族有關(guān)。其中Tau亞家族和Phi亞家族包含的GST基因數(shù)量最多，分別為13個和7個，這與其他植物GST基因家族中Tau和Phi 2個亞家族最多相一致。從物種親緣關(guān)系看，太子參和甜菜同屬于原始花被亞綱中央種子目，親緣關(guān)系相比于擬南芥、水稻等要近;本文將30個PhGST基因序列與擬南芥、水稻、甜菜等植物中的GST基因家族進行系統(tǒng)進化分析，顯示PhGST基因可分別與其他植物中同亞家族的GST基因聚為一支，且PhGST基因與甜菜中GST基因的距離最近，說明GST基因家族成員保守性與物種的進化程度具有很大的相關(guān)性。Tua和EF1Bγ兩個亞家族基因在太子參塊根中優(yōu)勢表達，推測這兩個亞家族在抵抗與土壤有關(guān)的逆境中發(fā)揮主導作用，可能參與了太子參藥材品質(zhì)的形成。

對PhGST基因家族在水分脅迫下的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，Phi家族的部分基因?qū)Νh(huán)肽HB的積累有正調(diào)控作用，EF1Bγ和Lambda家族的部分基因?qū)Νh(huán)肽HB的積累有負調(diào)控作用，Tua和Zeta 2個亞家族的部分基因?qū)偠嗵堑姆e累量有正調(diào)控作用，推測Tua、Zeta可以通過調(diào)節(jié)總多糖積累促進太子參塊根的膨大;Tua亞家族的部分基因?qū)傇碥盏姆e累量有負調(diào)控作用。本文鑒定到的Tau和Zeta家族的基因與擬南芥、水稻及甜菜等報道的GST基因家族具有較高同源性，從水稻中克隆到的Tau家族成員Osgstu30受PEG誘導表達，表明GSTs與植物水分脅迫響應相關(guān)（Dipali et al.， 2019），側(cè)面反映出太子參Tau家族可能在水分脅迫過程中發(fā)揮重要作用。康傳志等（2016）研究發(fā)現(xiàn)太子參環(huán)肽HB與年均降水量顯著正相關(guān)，因此我們推測PhGSTU8、PhEFB1γ3等基因可能參與了水分脅迫下環(huán)肽HB的合成調(diào)控，此兩類基因在太子參植物抗逆過程中可能發(fā)揮著重要作用，這為此類基因在太子參中的功能研究提供了方向。

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（責任編輯?何永艷）