朱麗華，章忠明，李 薇，馮 霞，王 芃，劉蘭燕

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.體檢部 健康管理部; b.血液內(nèi)科,廣西 南寧 530021;2.中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院 傳染病科,廣東 東莞 523110;3.廣西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)為臨床常見(jiàn)的急危重癥，特征是毛細(xì)血管屏障通透性增加，引起連續(xù)性肺水腫、氣體交換障礙和呼吸窘迫等癥狀[1-3]。巨噬細(xì)胞活化后可被分為兩種不同的表型：即具有促炎作用的 M1 型巨噬細(xì)胞和具有抗炎作用的M2 型巨噬細(xì)胞。研究表明，巨噬細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程，促進(jìn)炎癥消退和啟動(dòng)肺修復(fù)來(lái)預(yù)防ARDS中的破壞性過(guò)程[4-5]。NecroX化合物是一類由吲哚衍生的具有細(xì)胞保護(hù)作用的細(xì)胞滲透性壞死抑制劑，可通過(guò)線粒體ROS清除發(fā)揮抗氧化活性。NecroX-5可有效抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷和死亡[6]，并對(duì)肝臟疾病和神經(jīng)退行性疾病等具有治療作用[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NecroX-5干預(yù)ARDS大鼠探討其作用，并闡明這種抑制的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NecroX-5(美國(guó)Biovision)，LPS(美國(guó)Sigma)，TNF-α、IL-6、IL-23、iNOS ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成)，ECL發(fā)光液、HE 染色試劑和免疫組化染色試劑(北京索萊寶)，RNAiso Plus試劑(美國(guó)Thermo Fisher)、SYBR?Prime ScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒(日本Takara)，BCA蛋白定量試劑盒與PVDF膜(上海碧云天)，抗體CD86、iNOS、HMGB1、RAGE、β-actin(英國(guó)Abcam)，F(xiàn)ITC標(biāo)記 CD11c+抗體(美國(guó) BD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 巨噬細(xì)胞系RAW264.7來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。40只雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量180～220 g。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與造模 40 只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、NecroX-5組、LPS組、NecroX-5+LPS組，每組10只。NecroX-5組和NecroX-5+LPS組大鼠造模前7 d腹腔內(nèi)注射NecroX-5(10 mg/kg)誘導(dǎo)大鼠ARDS模型，每天1次，連續(xù)7 d，對(duì)照組和LPS組同時(shí)注射等量生理鹽水。7 d后，LPS組和NecroX-5+LPS組大鼠以2 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射LPS，對(duì)照組和 NecroX-5組大鼠同時(shí)注射等量生理鹽水，造模后24 h進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.4 肺泡灌洗液(BALF)收集與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè) 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將其四肢及頭部固定，消毒后打開(kāi)胸腔暴露氣管，在左主支氣管下端切一“十”字形小口，插入插管后進(jìn)行結(jié)扎固定，使用注射器將生理鹽水注入肺部進(jìn)行灌洗，輕柔按摩胸前區(qū)，30 s后緩慢抽回灌洗液，再將抽回的灌洗液緩慢注入，重復(fù)3次，直到可見(jiàn)乳白色泡沫狀液體表示灌洗成功，收集灌洗液，離心后取上清液，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-23、iNOS水平。

1.5 HE 染色 處死各組大鼠并摘取肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋后，切成厚度為4 μm的薄片。蘇木精染色5 min，流水沖洗，伊紅染色液染色3 min，再次流水沖洗，乙醇進(jìn)行脫水后自然晾干，二甲苯透明10 min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)改變并拍照。

1.6 免疫組化染色 將制備的肺組織石蠟切片脫蠟至水，0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。以CD68+與CD86+為細(xì)胞標(biāo)志物標(biāo)記巨噬細(xì)胞，加入抗體后4℃孵育過(guò)夜，次日，PBS 沖洗3 次，滴加二抗室溫孵育15 min，PBS 沖洗3次，DAB 顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明后，中性樹(shù)膠封片，在電子顯微鏡下觀察，并進(jìn)行圖像采集與分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNAiso Plus試劑說(shuō)明提取肺組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，根據(jù) SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)基因 mRNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃變性20 s、60 ℃ 退火15 s、72 ℃延伸45 s(40 個(gè)循環(huán))。引物由上海生工生物有限公司合成，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Western blot 肺組織和各組RAW264.7巨噬細(xì)胞研磨勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以30 μg蛋白上樣通過(guò) 10% SDS-PAGE電泳分離，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。TBST 清洗，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入一抗于4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST 洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST清洗，ECL發(fā)光液顯影，使用Image J系統(tǒng)對(duì)各條帶進(jìn)行定量分析。

1.9 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理 將RAW264.7 巨噬細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、NecroX-5組(加入含20μmol/L NecroX-5培養(yǎng)1 h)、LPS+IFNγ組(加入含100 ng/mL LPS和10 ng/mL IFNγ培養(yǎng)24 h)和NecroX-5+LPS+IFNγ組(加入含20μmol/L NecroX-5培養(yǎng)1 h，再加入含 100 ng/mL LPS和10 ng/mL IFNγ培養(yǎng)24 h)。

1.10 流式細(xì)胞術(shù) 收集各處理組巨噬細(xì)胞，消化并離心，加入200 μL PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入1 μL大鼠抗小鼠F4/80+CD11b+CD11c+(M1巨噬細(xì)胞)與F4/80+CD11b+CD11c-(M2巨噬細(xì)胞)，4℃避光孵育 30 min，PBS洗滌，每管加入200 μL PBS重懸細(xì)胞，吹打混勻后，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，CD11c+標(biāo)記百分率代表M1極化比例。

2 結(jié)果

2.1 NecroX-5對(duì)BALF中TNF-α、IL-6、IL-23與iNOS因子表達(dá)的影響 LPS組BALF中TNF-α、IL-6、IL-23、iNOS含量較對(duì)照組增加(P<0.05)；與LPS組比較，NecroX-5+LPS組TNF-α、IL-6、IL-23及iNOS含量均下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-23、iNOS含量比較(n=10，pg/mL)

2.2 NecroX-5對(duì)肺組織病理變化的影響 對(duì)照組與NecroX-5組大鼠肺組織的肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間隔正常，肺泡壁完整，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。LPS組肺組織中可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞、斷裂，相鄰肺泡腔相互融合成肺大皰，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。NecroX-5+LPS組大鼠肺組織肺泡破裂融合以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況較LPS組大鼠減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)各組大鼠肺組織病理變化(標(biāo)尺=50 μm)

2.3 NecroX-5對(duì)肺組織中CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，LPS組大鼠肺組織中CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.05)；NecroX-5+LPS組大鼠肺組織中CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)較LPS組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠肺組織CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)(標(biāo)尺=100 μm)

表2 各組大鼠肺組織中CD68+CD86+陽(yáng)性表達(dá)與iNOS、CD86 mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.4 NecroX-5對(duì)肺組織中 iNOS、CD86 mRNA 與蛋白表達(dá)的影響 LPS組肺組織中iNOS、CD86 mRNA與蛋白表達(dá)較對(duì)照組均增加(P<0.05)；NecroX-5+LPS組大鼠肺組織中iNOS、CD86 mRNA 和蛋白表達(dá)較LPS組均下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表2。

圖3 Western blot檢測(cè)肺組織中 iNOS、CD86 蛋白表達(dá)水平

2.5 NecroX-5對(duì)肺組織中HMGB1/RAGE信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，LPS組肺組織中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與LPS組比較，NecroX-5+LPS組肺組織中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)較LPS組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表3。

圖4 Western blot檢測(cè)肺組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)比較

2.6 各組巨噬細(xì)胞表型分析 與對(duì)照組比較，LPS+IFNγ組CD11c+標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率升高(P<0.05)；與LPS+IFNγ組比較，NecroX-5+LPS+IFNγ組CD11c+標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表4。

圖5 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞CD11c+ 表達(dá)流式細(xì)胞圖

表4 各組CD11c+ 標(biāo)記的RAW264.7巨噬細(xì)胞表達(dá)與HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)比較

2.7 各組巨噬細(xì)胞中HMGB1/RAGE信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 與對(duì)照組比較，LPS+IFNγ組巨噬細(xì)胞中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與LPS+IFNγ組比較，NecroX-5+LPS+IFNγ組巨噬細(xì)胞中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，NecroX-5不僅可以抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[8]。>此外，NecroX-5可抑制ROS的產(chǎn)生，在線粒體中表現(xiàn)出抗氧化活性，通過(guò)抑制線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)防止再氧化損傷[6]。但尚未有研究闡明NecroX-5在ARDS中的保護(hù)作用和機(jī)制。本研究使用LPS誘導(dǎo)大鼠ARDS，通過(guò)肺組織病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，并出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，但經(jīng)過(guò)NecroX-5干預(yù)的大鼠肺組織病變現(xiàn)象明顯較輕，說(shuō)明NecroX-5對(duì)大鼠ARDS引起的肺損傷具有一定的保護(hù)作用。

巨噬細(xì)胞作為重要的先天免疫細(xì)胞，在炎癥環(huán)境下可被激活并分化為兩種亞型，包括經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞M1和交替激活的巨噬細(xì)胞M2。M1巨噬細(xì)胞表達(dá)CD86等表面標(biāo)志物，并分泌促炎細(xì)胞因子例如iNOS來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)并清除病原體，而M2巨噬細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)和耐受性相關(guān)，可以表達(dá)CD206等表面標(biāo)志物，可分泌諸如Arg-1等抗炎細(xì)胞因子來(lái)限制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)受損組織的修復(fù)[5,9-11]。本研究結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠BALF中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TNF-α、IL-6、IL-23及iNOS的含量升高，同時(shí)肺組織中M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86表達(dá)增加，iNOS、CD86 mRNA與蛋白表達(dá)量增加，而通過(guò)NecroX-5干預(yù)的大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-23及iNOS的含量均下降，此外，肺組織中CD86表達(dá)降低，iNOS、CD86 mRNA與蛋白表達(dá)量減少，由此說(shuō)明巨噬細(xì)胞極化在ARDS后炎癥反應(yīng)和肺損傷中發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察NecroX-5對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的影響。使用LPS和IFNγ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞向M1型極化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS+IFNγ組細(xì)胞中F4/80+CD11b+CD11c+標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率明顯升高，而經(jīng)過(guò)NecroX-5預(yù)處理后再使用LPS和IFNγ誘導(dǎo)的細(xì)胞中F4/80+CD11b+CD11c+標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率明顯下降，由此推測(cè)NecroX-5可能會(huì)減弱LPS+IFNγ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1極化。

為進(jìn)一步探究NecroX-5發(fā)揮作用的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了HMGB1/RAGE信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠肺組織中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)量增加，而經(jīng)過(guò)NecroX-5干預(yù)的ARDS大鼠肺組織中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)量則下降。HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，廣泛分布在真核生物細(xì)胞核中，HMGB1作為一種炎癥細(xì)胞因子，可以參與巨噬細(xì)胞激活與各種免疫疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。HMGB1的促炎作用是通過(guò)幾種受體介導(dǎo)的，例如TLR2、TLR4和RAGE 受體[13]。其中RAGE是一種跨膜蛋白的免疫球蛋白超家族成員，研究表明，HMGB1可通過(guò)調(diào)控RAGE受體途徑誘導(dǎo)呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激損傷[14]。

綜上所述，NecroX-5能調(diào)控ARDS 過(guò)程中M1型巨噬細(xì)胞極化，并抑制 ARDS 過(guò)程中炎癥因子HMGB1、RAGE的表達(dá)，使肺組織病理改變減輕，這為NecroX-5應(yīng)用于 ARDS 臨床治療提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與依據(jù)。