尹貴彬，金春明，李亞南，宮方巖，張雯瓊

(牡丹江醫(yī)學院1.研究生處；2.附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一組多基因的異質(zhì)性腫瘤疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化的趨勢，嚴重影響女性的身心健康[1]。乳腺癌早期的診斷效能對提高患者的預(yù)后生存期至關(guān)重要，傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖蛋白抗原153(carbohydrate antigen153，CA153)的敏感度和特異性較差[2]，臨床上常用的乳腺鉬靶X線對女性身體具有一定的放射性危害，所以需要靈敏度更高、特異性更好和更為安全的乳腺癌腫瘤標志物用于乳腺癌的早期診斷及治療。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼RNA，在細胞的生長、增殖、分化和凋亡過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，參與細胞的生命活動[3]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌或抑癌作用。目前國內(nèi)外研究表明，miR-596在多種惡性腫瘤中均有異常表達，但鮮有miR-596在乳腺癌患者診斷中的報道。本研究旨在通過探討miR-596在乳腺癌組織中的表達及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為乳腺癌的早期臨床診斷提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2019年3月至2019年12月間牡丹江市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的乳腺癌癌組織、癌旁正常組織各40例，新鮮標本置于液氮中轉(zhuǎn)運，放入-80 ℃冰箱保存。納入標準：(1)所有患者均經(jīng)病理組織活檢確診為乳腺癌；(2)臨床病歷資料完整；(3)所有患者術(shù)前均未接受放療化療、免疫治療等措施；(4)年齡大于18歲。排除標準：(1)患有慢性疾病及其他腫瘤患者；(2)精神疾病患者；(3)非女性患者。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌TNM分期第八版對患者進行Ⅰ～Ⅳ期分期。根據(jù)WHO(2012版)乳腺腫瘤分類標準，由兩位病理科醫(yī)師對所有病例進行病理診斷。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和設(shè)備總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen)、Trizol試劑(美國Invitrogen)、Master Mix檢測試劑盒(德國Roche公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo)、PCR引物(上海生工)，實時熒光定量PCR儀(美國Thermo FisherQuantstudio3)；兔抗人多克隆抗體、ER、PR、Her-2、Ki-67單克隆抗體及二抗試劑盒(福州邁新)，孵育盒(福州邁新BOX-1001)、染色缸(福州邁新RAK-3001)、切片盒(福州邁新BOX-3001)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏GNP-9080)，顯微鏡(奧林巴斯CX41)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 取組織標本于研缽中加入液氮研磨成粉末，取50～100 mg組織粉末加入1 mL的Trizol液的EP管中，冰上勻漿1～2 min，室溫放置5 min；加入200 μL的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15 s；室溫放置3 min，待溶液分層后，4 ℃、11750 g離心10 min；取上層無色液相于一新的EP管中，加入500 μL異丙醇，溫和顛倒混勻。室溫放置10 min，4 ℃、11750 g離心10 min；棄去上清液，加入1 mL的75%乙醇，渦旋混勻，4 ℃下11750 g離心5 min，重復(fù)操作一次；棄上清，室溫干燥5～10 min(去除乙醇)，加入30 μL RNase-Free H2O溶解RNA。微量分光光度計檢測RNA濃度及純度,吸光度比值>1.8符合檢測標準。

1.3.2 miR-596檢測 采用實時熒光定量PCR檢測患者組織中miR-596的表達情況，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Real-time PCR儀上對miR-596進行擴增，以U6為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：RNA sample 10 μL，10XRT Buffer 2.0 μL，25 X dNTP Mix(100mM) 0.8 μL，10XRT Randon Primers 2.0 μL，MμLtiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μL，RNase inhibitor 1.0 μL，Nuclease-free H2O 3.2 μL；反應(yīng)條件25 ℃ 30 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。擴增反應(yīng)體系20 μL：2XAllinOneTMQ-PCR Mix 10 μL，cDNA template 1.0 μL(100 ng/μL)，Nuclease-free H2O 7.0 μL，PCR特異引物F(10 μM)1.0 μL，PCR特異引物R(10 μM)1.0 μL；反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)數(shù)。采用ΔΔCт的相對定量：各樣品目的基因miR-596和內(nèi)參基因U6的CT值直接由儀器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其內(nèi)參基因的濃度，以N=2-△CT表示標本miR-596的相對表達量,其中△CT=CTmiR-596-CTU6。

1.3.3 免疫組織化學檢測人類表皮生長因子受體-2(Her-2)、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)、增殖細胞核抗原(Ki-67) 患者乳腺癌組織手術(shù)標本，先用10%福爾馬林溶液進行固定，再行常規(guī)脫水，石蠟包埋切片處理，切片厚度4 um，HE染色鏡下觀察。免疫組織化學染色，一抗分別為ER、PR、Her-2、Ki-67；以PBS代替一抗作為陰性對照組，具體操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。ER、PR及Ki-67定位于癌細胞核，有淡黃、棕黃或棕褐色顆粒為陽性；Her2定位于細胞膜，有棕黃色顆粒為陽性；根據(jù)陽性細胞染色程度和百分率進行半定量分析。(-):無顯色反應(yīng)；(+):陽性細胞數(shù)<25%，染色呈棕黃色；(++):陽性細胞數(shù)25%～50%，染色呈棕黃或棕色；(+++):陽性細胞數(shù)>50%，染色呈棕色或深棕色。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，miR-596的相對表達水平以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，即M(P25，P75)表示。配對樣本間比較采用配對t檢驗，兩組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗，多組獨立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-596的相對表達水平miR-596在乳腺癌組中表達水平顯著低于乳腺癌癌旁組織中的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 miR-596在乳癌腺癌組織及癌旁組織的相對表達水平[M(P25，P75)]

2.2 miR-596相對表達水平與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系miR-596在乳腺癌組織中的相對表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期及Ki-67表達有關(guān)(P<0.01)，與患者的年齡、Her-2、ER及PR的表達均無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 miR-596相對表達水平與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系[M(P25，P75)]

2.3 miR-596相對表達水平與TNM分期及Ki-67間的相關(guān)性分析通過Spearman秩相關(guān)分析,miR-596相對表達水平與TNM分期呈負相關(guān)(r=-0.599，P<0.001)見圖1。miR-596相對表達水平與Ki-67呈相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，見圖2。

圖1 miR-596相對表達水平與乳腺癌TNM分期之間的相關(guān)性

圖2 miR-596相對表達水平與乳腺癌Ki-67之間的相關(guān)性

3 討論

microRNA-596(miR-596)位于人染色體8p23.3上，是一種基因間miRNA基因[4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miR-596與腫瘤的發(fā)病機制具有密切的相關(guān)性[5-6]，miR-596在多種癌癥中起著抑癌作用，而其在乳腺癌中的功能和作用仍缺乏研究。

本研究采用實時熒光定量PCR檢測了miR-596在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，相對于癌旁正常組織，miR-596在乳腺癌組織中相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，說明miR-596低水平表達可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，為乳腺癌的診斷提供了一個潛在的分子診斷標志物，但是該作用機制還不夠明確，需要進一步的研究驗證。

為了進一步發(fā)現(xiàn)miR-596在乳腺癌發(fā)展中的作用，結(jié)合miR-596與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-596在乳腺癌組織中的表達與與患者的年齡、Her-2、ER及PR的表達均無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期及Ki-67表達有關(guān)(P<0.01)。在40例乳腺癌患者中，miR-596在腫瘤大小<2 cm的患者中表達水平顯著高于腫瘤大小>2 cm的患者，miR-596在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達水平顯著高于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。同時通過miR-596與TNM分期及Ki-67間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-596水平與TNM分期負相關(guān)(r=-0.599,P<0.001),miR-596與Ki-67負相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，這與結(jié)果中miR-596表達水平隨著TNM分期增加表達水平降低和miR-596表達水平在Ki-67陽性的乳腺癌組織中低一致。人類表皮生長因子受體-2(Her-2)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及增殖細胞核抗原(Ki-67)是乳腺癌常用的免疫組化指標，ER和PR與乳腺癌的惡性程度負相關(guān)[7-8]，Her-2陽性表達率越高患者預(yù)后越差[9]；Ki67陽性表率達越高，癌細胞增殖活性越高，預(yù)后越差[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-596與Her-2、ER及PR的表達均無關(guān)(P>0.05)，與Ki-67表達有關(guān)(P<0.01)。本研究中mi-596在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中低表達，并隨著TNM分期增加表達水平逐漸降低，為mi-596在乳腺癌中的作用提供更進一步的依據(jù)。同時通過miR-596與Ki-67的相關(guān)性分析，表明miR-596與Ki-67之間呈負相關(guān)(r=-0.891，P<0.001)，miR-596表達水平越低，Ki67陽性表率達越高，提示患者預(yù)后越差。

綜上所述，miR-596可能在乳腺癌中起著抑癌作用，若能夠通過更深入的靶基因預(yù)測技術(shù)及相關(guān)實驗研究，更進一步的研究miR-596在乳腺癌中的作用機制，有望為乳腺癌的診治提供一個新的思路與研究靶點。