白紅紅，金 鵬，李 景，李 衛(wèi)，劉喜綱，劉翠哲*

（1.承德醫(yī)學院，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000；2.晨光生物科技集團邯鄲有限公司，河北 邯鄲 056000）

黃芩苷（結構式見圖1）屬黃酮類化合物，是黃芩的主要成分之一。黃芩苷作為提取物被收錄于2015 年版《中國藥典》，是黃芩通過水提酸沉制備得到，純度不低于85%，但得到的黃芩苷幾乎不溶于水，口服生物利用度低，大鼠口服給藥后僅為（2.2±0.2）%，嚴重限制了其臨床應用［1-2]。

圖1 黃芩苷結構式

為提高黃芩苷的溶解度，國內外研究人員采用納米晶藥物輸送系統(tǒng)［3-4]、靶向脂質體等技術［5]，但程度有限。課題組前期研究證明，黃芩苷在黃芩中的原本存在形式是鎂鹽形式（結構式見圖2），并通過提取得到了黃芩苷鎂，其溶解度比黃芩苷提高了2 225 倍［6]，并已獲國家發(fā)明專利和美國專利授權［7]。

圖2 黃芩苷鎂鹽結構式

深入研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對病毒性肝炎、酒精肝、化學性肝損傷、肝纖維化、肝衰竭、肝癌等具有一定的作用［8]，在臨床上已有黃芩苷片、黃芩苷膠囊等制劑，主要用于治療急慢性肝炎。無論是單體給藥還是復方給藥，黃芩苷在體內均呈二房室模型，半衰期相對較短（約15 min），消除半衰期相對較長（約200 min），這種藥代動力學特征適合靜脈給藥系統(tǒng)［9]。黃芩苷鎂鹽作為黃芩苷的原本存在形式，前期研究表明其藥代動力學特征與黃芩苷相同［10]，而且水溶性好，毒性低，適合做成注射劑，具有很大的成藥性和臨床應用前景。

本實驗制備了黃芩苷鎂鹽凍干粉，并測定其含量?？紤]到臨床靜脈給藥的特點，擬進行配伍穩(wěn)定性試驗，考察它在生理鹽水、5% 葡萄糖溶液、10% 葡萄糖溶液中的穩(wěn)定性。

近期研究表明，黃芩苷對CCl4所致肝細胞的氧化損傷有保護作用，其機制與其誘導HO-1 表達及抑制促炎介質有關［11-12]。同時也有研究表明，鎂離子能夠降低肝損傷小鼠肝指數(shù)、血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性、MDA 水平，對抗和清除自由基，提高氧化酶活性，抑制TNF-α 分泌［13]。黃芩苷鎂鹽含有鎂離子，但黃芩苷在發(fā)揮對肝臟損傷的保護作用同時，鎂離子對肝損傷的保護是否存在協(xié)同作用尚不明確，需作進一步研究。

1 材料

1.1 儀器 N-1100 旋轉蒸發(fā)器（日本理化公司）；LGJ-22D 冷凍干燥機（北京四環(huán)科學儀器廠有限公司）；1260HPLC 色譜儀（美國安捷倫科技公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市天竟實驗儀器廠）；PH 計（瑞士梅特勒-托利多公司），SPESTRO star Nano 全波長酶標儀（德國BMG LABTECH 公司）；HP-8453 分光光度計（美國惠普公司）；全自動脫水機（北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；Histocore Arcadia C 石蠟包埋機、RM2235 cwEU 切片機（上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）；Nikon DS-Fi1 電子顯微鏡（日本尼康株式會社）；Velocity 14R 高速低溫離心機（英國Dynamica 公司）；SCIEN-48 高通量組織研磨機（寧波新芝生物科技有限公司）；AG-A254 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；JA-2003 電子天平（上海精科天平有限公司）；KQ-300 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GHX-9080B 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）。

1.2 試劑 黃芩苷原料藥（承德頸復康藥業(yè)集團霧靈藥業(yè)有限責任公司）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201318，純度≥93.3%）。氫氧化鎂（天津市風船化學試劑科技有限公司）；生理鹽水、5%葡萄糖、10%葡萄糖注射液（石家莊四藥有限公司）；異甘草酸鎂注射液（連云港正大天晴藥業(yè)股份有限公司）；硫酸鎂、四氯化碳（天津歐博凱化工有限公司）；橄欖油（山東魯花集團有限公司）。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ALT、AST、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GSH 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。娃哈哈純凈水（高碑店娃哈哈啟力飲料有限公司）；氨基甲酸乙酯（國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物 wistar 大鼠36 只，雄性，體質量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，在屏障動物房適應性飼養(yǎng)一周，控制室內溫度20～22 ℃，相對濕度50%～60%，光照時間8：00 至20：00，給予充足的飼料和飲用水。本實驗所涉及的動物相關操作嚴格遵守有關準則，并經(jīng)承德醫(yī)學院實驗動物福利倫理委員會的批準。

2 方法

2.1 注射用黃芩苷鎂鹽凍干粉的制備 在500 mL 圓底燒瓶中先后加入黃芩苷原料藥5 g、氫氧化鎂0.138 g、蒸餾水200 mL，將圓底燒瓶置于旋轉蒸發(fā)器上，60 ℃水浴，低速旋轉1 h，反應完全后為棕黃色溶液，抽濾，除去不溶性雜質，活性炭吸附除去熱源，過0.45 μm 濾膜，固體物冷凍干燥40 h，得黃芩苷鎂鹽凍干粉。

2.2 HPLC 分析

2.2.1 色譜條件 參考2015 年版《中國藥典》 相關規(guī)定，黃芩苷鎂鹽分析方法為phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（60∶40）；檢測波長278 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 專屬性試驗 分別取供試品溶液和生理鹽水注射液，黃芩苷鎂鹽加生理鹽水注射液，5%、10%葡萄糖注射液，在“2.2.1”項色譜條件下分析，結果見圖3。由此可知，3 種溶劑對測定無影響。

圖3 黃芩苷鎂鹽HPLC 色譜圖

2.2.3 線性關系考察 精密稱取一定量黃芩苷對照品，配制成500 μg/mL 貯備液，稀釋成22.08、22.16、70.656、85.56、176.64、353.28 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，將質量濃度X 與峰面積Y 進行回歸，得方程Y=35.51X+132.27（r=0.999 1），在22.08～353.28 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.4 方法學考察 在“2.1.1”項色譜條件下分別考察精密度、重復性、加樣回收率，測得精密度RSD 為0.90%（n=6）；重復性RSD 為1.38%（n=6）；平均加樣回收率為100.24%，RSD 為1.06%（n=6），均符合要求。

2.3 注射用黃芩苷鎂鹽在不同溶劑中的穩(wěn)定性 精確稱取黃芩苷鎂鹽140.0、213.0、427.0 mg 各3 份，分別溶于250 mL 生理鹽水注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液中并充分攪拌，25 ℃水浴中于0、0.5、1、2、4、6、8 h 觀察外觀變化，測定溶液pH 值及黃芩苷鎂鹽含量，結果見圖4。由此可知，在0～8 h 內各組pH 值略有下降，穩(wěn)定在6.6～7.2 之間；各組約有5% 的黃芩苷鎂鹽被破壞，穩(wěn)定性較好，無氣泡沉淀產(chǎn)生，顏色無變化，溶液澄清透明，達到了注射液的一般質量要求。

圖4 不同濃度黃芩苷鎂鹽在各溶劑中的pH、含量變化

2.4 藥效學實驗

2.4.1 分組及給藥 大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為空白組、模型組、黃芩苷鎂鹽組、異甘草酸鎂組、黃芩苷組、硫酸鎂組，每組6 只，根據(jù)前期預試驗選擇給藥量為50 mg/kg。黃芩苷和硫酸鎂組（以鎂離子計）給藥劑量以黃芩苷鎂鹽組為標準，分別等量換算為48.8、1.3 mg/kg。異甘草酸鎂注射液臨床上治療急性肝損傷指導用藥量為0.2 g/d，按式（1）換算大鼠給藥劑量為18 mg/kg（Km為表面積和體質量的比值，人為37，大鼠為6）。設計給藥方式為每天2 次，每次按給藥劑量一半尾靜脈注射給藥，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥1 周，記錄大鼠攝食量和飲水量。末次給藥2 h 后，空白組大鼠腹腔注射橄欖油（等量），其他各組大鼠腹腔注射50%CCl4（橄欖油稀釋）1 ml/kg，禁食，自由飲水。

2.4.2 取材 造模24 h 后，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯10 mg/kg 麻醉，腹主動脈取血5 mL，冰浴靜置1 h，離心（4 ℃、3 000 r/min）10 min，取上清測定ALT 和AST水平。取出肝臟，用預冷的生理鹽水沖洗2 次，擦拭干凈后稱重，計算肝指數(shù)，結果見表1。取肝左葉，用10%甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察肝組織病理變化，結果見圖5。剩余肝組織加入9 倍量生理鹽水制得10%肝組織勻漿，離心（4 ℃、3 000 r/min）10 min，取上清液測定MDA、GSH 水平。

2.4.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 軟件處理，計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

由表1 可知，與空白組比較，模型組ALT、AST 活性和肝指數(shù)增高（P＜0.01），表明模型復制成功。與模型組比較，給藥組大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)均有不同程度的降低（P＜0.01，P＜0.05）；黃芩苷鎂組血清中ALT、AST 活性低于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05，P＜0.01），肝指數(shù)低于黃芩苷組（P＜0.05）。

表1 用藥組對肝損傷大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)的影響（，n=6）

表1 用藥組對肝損傷大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)的影響（，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，＃＃P＜0.01；與黃芩苷鎂鹽組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

由表2 可知，與空白組比較，模型組肝臟中的MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組MDA 水平均有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芩苷鎂組中MDA水平低于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05）。與空白組比較，模型組GSH 水平降低（P＜0.01），黃芩苷鎂鹽組GSH 水平高于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 用藥組對肝損傷大鼠肝組織MDA、GSH 水平的影響（，n=6）

表2 用藥組對肝損傷大鼠肝組織MDA、GSH 水平的影響（，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，＃＃P＜0.01；與黃芩苷鎂鹽組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖5 顯示，空白組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞結構完整，無炎細胞浸潤。模型組肝索排列紊亂，細胞間隙變大，肝細胞結構明顯破壞，呈脂肪性泡沫病變。黃芩苷鎂組肝細胞病變不明顯，肝細胞輕度腫脹，部分肝細胞脂肪變性，匯管區(qū)有少量炎細胞浸潤。異甘草酸鎂組依然可見氣球樣病變，肝臟保護效果不及黃芩苷鎂組。黃芩苷組和硫酸鎂組也可降低肝細胞腫脹和組織病變程度，但病變程度均大于黃芩苷鎂鹽組。

圖5 各組肝損傷大鼠肝病理切片（HE，×100）

4 討論

注射劑的配伍液穩(wěn)定性問題主要體現(xiàn)在室溫條件下溶液顏色變化、產(chǎn)生氣泡及產(chǎn)生不溶性微粒、pH 值的變化，一定溫度和時間內溶液澄明、顏色無改變、無氣泡及肉眼可見的沉淀產(chǎn)生，pH 值穩(wěn)定，提示藥物可配伍。除了從溶液外觀、pH 值等理化性質方面考察配伍穩(wěn)定性外，還測定了藥物在溶劑中的含量變化，結果顯示不同濃度黃芩苷鎂鹽在生理鹽水、5%葡萄糖、10%葡萄糖注射液中理化性質和含量保持穩(wěn)定。在配伍穩(wěn)定性的基礎上將黃芩苷鎂鹽溶解于生理鹽水注射液中，配制成一定濃度的注射液開展保肝作用研究。

肝臟是人體的重要器官，目前數(shù)以百萬計的人因酒精、化學品和感染而使肝臟遭受損害，其中化學物質諸如對乙酰氨基酚、CCl4、亞硝胺和多環(huán)芳烴等對肝臟的損害很大。CCl4所致的肝損傷是肝損傷模型的首選，它可引起與肝硬化或肝炎相同的肝臟改變、單個核細胞浸潤和肝細胞脂肪性泡沫變性。CCl4誘導的肝毒性被認為涉及2 個階段，最初階段是由細胞色素P450 代謝CCl4，導致自由基的形成和脂質過氧化［14]；第二階段由于自由基引起Kupffer 細胞激活，并伴隨炎癥介質的產(chǎn)生［15]。由于肝損傷，肝細胞膜的滲透性改變，膜的滲透性改變導致細胞中的酶釋放到體循環(huán)。其中ALT 在肝實質細胞漿合成，其血清中活性增高提示肝細胞膜破壞和肝細胞通透性增加。AST 在肝實質細胞線粒體合成，其血清中活性增高提示肝細胞線粒體損傷。本研究中，大鼠腹腔注射CCl424 h 后，模型組血清中ALT和AST 水平明顯增高，而黃芩苷鎂鹽可以減緩這種趨勢。

MDA 是脂質過氧化物的最終產(chǎn)物，它在血清及組織中的水平高低反映了組織過氧化時的損傷程度［16]。因此，肝組織內MDA 水平的變化可反映肝損害的程度及治療后肝功能恢復的情況。GSH 是抵抗自由基的第一道防線，是組織氧化損傷易感性的重要決定因素，關于CCl4肝毒性機制研究表明，GSH 在CCl4活性毒性代謝產(chǎn)物的解毒中起著關鍵作用，肝壞死始于GSH 儲存的耗盡［17]。本實驗發(fā)現(xiàn)黃芩苷鎂鹽能顯著降低肝組織中MDA 水平，減緩大鼠GSH 水平的降低，與陽性對照藥異甘草酸鎂效果相當，明顯優(yōu)于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組。

黃芩苷具有多酚羥基結構，能夠清除和抑制自由基，保護線粒體膜的完整性，此外還能夠促進血紅素對氧酶-1（HO-1）和過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）的表達，下調TGFβ1信號通路抑制肝星狀細胞活化［18]，同時能夠抑制炎癥介質因子表達。CCl4可通過抑制細胞膜上和線粒體膜上鈣離子泵的活性使鈣離子大量內流，激活肝細胞膜上的磷酸化酶從而引起膜的脂質過氧化［19]。鎂是體內重要的常量元素，是鈣的天然拮抗劑，它能影響鈣的膜滲透性及其結合、分布和交換，通過減輕細胞內鈣超載達到肝保護作用。臨床報道，肝損傷往往伴隨低鎂血癥，適當補充鎂離子改善低血鎂癥對肝細胞有保護作用。

實驗結果顯示，黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導的肝損傷有保護作用，并優(yōu)于等濃度的黃芩苷和硫酸鎂，其結構中的黃芩苷和鎂離子存在協(xié)同作用而共同達到保肝效果。其中，黃芩苷主要通過阻斷自由基的脂質過氧化，保護細胞內線粒體復制、增生及粗面內質網(wǎng)的變化，恢復肝細胞生物氧化功能，促進相關蛋白質合成，為肝臟再生和修復提供相應的能量。同時，鎂離子可以有效抑制肝細胞內鈣超載，減輕肝細胞膜的脂質過氧化。

黃芩苷鎂鹽作為黃芩苷的原本存在形式，本身水溶性較好，在以上3 種溶劑中的理化性質和含量保持穩(wěn)定，具有很大的成藥性和臨床應用前景。因此，黃芩苷鎂鹽作為治療人類氧化應激和炎癥性肝病的一種可能的治療手段值得研究，在臨床上的應用潛力也有待進一步探討。